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丹皮酚对强直性脊柱炎模型小鼠Wnt和BMP/Smad信号转导通路的影响
作者：吴琪 吴倩 周晓红 吴玲慧 来源：《中国药房》2018年第11期
中圖分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）11-1500-05 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.11.15
摘 要 目的：研究丹皮酚对强直性脊柱炎（AS）模型小鼠分泌型糖蛋白（Wnt）和骨形态发生蛋白（BMP）/细胞信号转导分子（Smad）通路的影响，探讨丹皮酚防治AS的机制。方法：将40只小鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组（阳性对照，9 mg/kg）和丹皮酚组（3 mg/kg），每组10只。除正常组外的其余各组小鼠均采用完全弗氏佐剂+蛋白聚糖腹腔注射法复制AS模型。各给药组小鼠在成模后灌胃相应药物，正常组和模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水，每天给药1次，连续20 d。末次给药后处死小鼠，透射电镜下观察各组小鼠骶髂关节滑膜细胞超微病理结构变化，采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、Wnt信号通路病理性骨化相关因子（DKK-1）含量，实时荧光定量聚合酶链式反应法检测小鼠滑膜组织中骨形态发生蛋白2（BMP-2）、细胞内核心结合因子α1（Cbfα1）、Smad1 mRNA表达。结果：与正常组比较，模型组小鼠血清中TNF-α含量明显增加、DKK-1含量明显减少，滑膜组织中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表达水平明显升高，差异均有统计学意义（P 关键词 丹皮酚；强直性脊柱炎；分泌型糖蛋白；骨形态发生蛋白/细胞信号转导分子；小鼠
Effects of Paeonol on Wnt and BMP/Smad Signal Transduction Pathway in the Ankylosing Spondylitis Model Mice
WU Qi1，WU Qian2，ZHOU Xiaohong3，WU Linghui4（1.Teaching and Demonstration Center of Clinical Skill， Hubei University of TCM， Wuhan 430061， China；2.Hemodialysis Room， South Branch of Shanghai East Hospital， Shanghai 200123， China；3.College of Acupuncture and Orthopaedics-Traumatology， Hubei University of TCM， Wuhan 430061， China；4.Dept. of Immunology， Child Health Center， Xianning Center for Maternal and Child Health Care， Hubei Xianning 437000， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of paeonol on Wnt and BMP/Smad pathway in ankylosing spondylitis （AS） model mice， and to investigate prevention and treatment mechanism of paeonol for AS. METHODS： 40 mice were randomly divided into normal group， model group， sulfasalazine group （positive control， 9 mg/kg） and paeonol group （3 mg/kg）， with
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10 mice in each group. In addition to the normal group， Freund’s adjuvant and proteoglycan were used to establish AS model in each group. After modeling， mice in each administration group were given relevant medicine intragastrically； normal group and model group were given constant volume of distilled water intragastrically， once a day， for consecutive 20 d. After last administration， the mice were killed， TEM was used to observe the ultrastructural pathologic change of synovial cells in articulationes sacroiliaca. The serum contents of TNF-α and DKK-1 were determined by ELISA， and the mRNA expressions of BMP-2， Cbfα1 and Smad1 in synovial tissue were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. RESULTS： Compared with normal group， serum content of TNF-α in model group was increased significantly， while serum content of DKK-1 was decreased significantly； mRNA expressions of BMP-2， Cbfα1 and Smad1 in synovial tissue were increased significantly， with statistical significance （P
KEYWORDS Paeonol； Ankylosing spondylitis； Wnt； BMP/Smad； Mice
強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是以骶髂关节和脊柱慢性炎症为主的全身性疾病[1]，最终病变发展为中枢关节的纤维化和骨性强直[2]，并由此引起腰背僵硬或疼痛、脊柱强直、畸形愈合等临床症状[3]。据统计，我国AS患病率为0.3%，且好发于青、中年男性[4]，具有较高的致残率和至畸率，目前已成为国内外人口与健康研究领域的研究重点[5]。病理形成骨是AS患者致残的主要原因，AS治疗最终必须解决正常韧带及滑膜骨化强直问题[6]。成骨过程受多种因素、多个信号路径的调节，经典的分泌型糖蛋白（Wnt）和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路在调节成骨细胞功能及骨形成中发挥重要的协同作用[7-8]。研究表明，肿瘤坏死因子α（TNF-α）是触发AS“炎症因子风暴”级联瀑效应的关键因子之一，其与AS韧带骨化具有密切的联系[9]。
丹皮酚（Paeonol）为萝藦科植物徐长卿的主要药理成分，具有与非甾体类抗炎药相似的药理作用，包括解热镇痛、抗炎、抗氧化、调节细胞免疫、诱导肿瘤细胞凋亡以及抗辐射等，且不良反应少，具有治疗慢性炎症风湿性疾病的潜力[10-12]。目前，关于丹皮酚抑制多种肿瘤作用的研究报道较多，而关于其对AS病理性骨化相关信号转导通路的影响尚未见报道。故本研究以蛋白聚糖（PG）诱导的AS小鼠为模型，通过观察骶髂关节滑膜细胞超微病理结构变化，检测血清中炎症相关细胞因子TNF-α和Wnt信号通路病理性骨化相关因子（DKK-1）的含量，研究丹皮酚对滑膜细胞BMP-2、Smad1及Cbfα1 mRNA表达的影响，探讨其对Wnt和BMP/Smad病理性骨化相关信号转导通路的调控作用，为丹皮酚临床治疗AS以及阐明其作用机制提供依据。 1 材料 1.1 仪器
HT-770型透射电镜（日本日立高新技术公司）；C2500-R-230V微型高速离心机（美国Labnet公司）；ICV-450型电热恒温培养箱（日本Asone科学仪器公司）；Multiskan MK3型
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全自动酶标仪（美国Thermo公司）；DHG 9203A型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Iiiumina生物科技公司）；Nano-100型微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）。 1.2 药品与试剂
丹皮酚片（广西亿康药业股份有限公司，批号：H45021119，规格：40 mg/片）；柳氮磺吡啶肠溶片（上海信谊天平药业有限公司，批号：H31020557，规格：0.25 g/片）；PG（美国Sigma公司，批号：D-8428，纯度：>99%）；完全弗氏佐剂（美国MP Bio公司，批号：642857，纯度：>99%）；小鼠TNF-α酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号：E-EL-M0049c）、小鼠DKK-1 ELISA试剂盒（批号：E-EL-M0024c）均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒（Trizol，北京艾德莱生物科技有限公司，批号：
252250AX）；Hiscript逆转录酶（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：R101-01/02）； Taq Plus DNA Polymerase聚合酶、DL2000 DNA Marker（北京天根生化科技有限公司，批号：ET105-01、D114-02）；PCR引物由北京擎科生物技术公司合成；其余试剂均为分析纯。 1.3 动物
清洁级BALB/c小鼠40只，♂，鼠龄（16±4）周，体质量（20±3） g，由武汉大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0004。实验过程中对动物的处置符合科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。 2 方法 2.1 分组与造模
将小鼠适应性饲养1周后随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组和丹皮酚组，每组10只。除正常组外，其余3组小鼠均复制AS模型，具体操作如下：将完全弗氏佐剂100 μL、PG 100 μL混合，分别在第0、3、6周注入小鼠腹腔[13]。 2.2 给药与取材
参照临床用药剂量，丹皮酚的小鼠给药剂量为3 mg/kg（临用前用蒸馏水溶解后配成0.3 mg/mL的溶液），柳氮磺吡啶的小鼠给药剂量为9 mg/kg（临用前用蒸馏水溶解后配成0.9 mg/mL的溶液），正常组和模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水。从造模成功后的第1天开始，各组小鼠分别灌胃相应药物，每日1次，连续用药20 d。末次给药后，摘除小鼠眼球，通过眼底静脉丛采血800～1 000 μL，以离心半径为6 cm、3 000 r/min离心10 min，留取血清，-20 ℃冰箱保存；并于小鼠骶髂关节切取滑膜组织置于冻存管中，-80 ℃冰箱保存。 2.3 血清中TNF-α、DKK-1含量测定