实验四 叶绿体的分离与观察 一、实验目的
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解差速离心分离细胞器的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的形态。 二、实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol／L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1 000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3 000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。 三、实验用品 1、器材
主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
小型器材：烧杯2个，10ml量筒，滴管，离心管，纱布若干，载片及盖片。 2、材料：新鲜菠菜。
3、试剂：0.35mol/L NaCl溶液。 四、实验方法
1、叶绿体的分离与观察
（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称6g于研钵中，加10ml 0.35mol/L NaCl溶液，用研钵捣碎成匀浆状。 (2)将匀浆用4层纱布过滤于50ml烧杯中。
(3)取滤液4ml于离心管中，在1000r/min下离心2min（注意离心前用天平配平）。 (4)将上清液倒入另一个干净的离心管中。
(5)将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(可能混有部分细胞核)，
(6)将沉淀用2 ml 0.35mol/L NaCl溶液悬浮（用滴管吹打沉淀使之悬浮）。 (7)用滴管取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后（用滤纸吸掉多余的液体）即可在普通光镜下观察（10×，40×，100×）。
(8)叶绿体悬液如果过浓，用0.35mol/L NaCl溶液稀释后重新制片观察。 2、菠菜叶切片观察
用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／L NaCl溶液，盖片后轻压，置普通显微镜下观察。 五、实验结果
1、画出高倍镜下的叶绿体图（多角度）；
2、说明0.35mol/LNaCl溶液的作用，是否可以蒸馏水代替。
实验五 掌握植物细胞骨架（微丝）的观察方法 一、实验目的：光镜下观察细胞骨架。 二、实验原理：
1、原理：在一定时间内，用适当浓度的TritonX-100(曲拉通X-100)处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮蓝R250染色，可在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。
2、细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。在细胞中支持和连接细胞各组份，与细胞运动有关的结构，包括微丝（MF）、微管（MT）、中间纤维。 3、TritonX-100：非离子型去垢剂，在一定时间内可消除细胞骨架外部杂蛋白，而骨架蛋白得以保留但长时间作用，也会破坏骨架蛋白。 4、M-缓冲液：增加膜稳定性，冲洗TritonX-100。 5、戊二醛：固定剂，使骨架蛋白变性，但网络形态不变。 6、考马斯亮兰R250：蛋白质染色剂（无选择特异性）。
三、试剂材料：M-缓冲液6mMol/L pH6.8；1% Triton X-100溶液 ； 2.5%戊二醛；0.2%的考马斯亮兰R250；PBS溶液；洋葱。 四、实验方法：
1.撕洋葱内表皮，置PBS液中，使之沉降3-4小时； 2.用镊子取几片处理好的洋葱内表皮，置于表面皿中；
3.用滤纸吸去PBS液，加入1%Triton x-100浸没，经常翻动洋葱内表皮。（处理时间15，17，19，21，23分钟）处理时每人选一个时间，处理结束后倒掉1%Triton x-100，用滤纸吸去多余液体。
4.加入适量的（达到完全浸泡）M-缓冲液，浸泡3-5分钟，倒掉液体。重复3次； 5.用滤纸吸去多余液体；
6.加