实验四 叶绿体的分离与观察 一、实验目的
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解差速离心分离细胞器的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的形态。 二、实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol／L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1 000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3 000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。 三、实验用品 1、器材
主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
小型器材：烧杯2个，10ml量筒，滴管，离心管，纱布若干，载片及盖片。 2、材料：新鲜菠菜。
3、试剂：0.35mol/L NaCl溶液。 四、实验方法
1、叶绿体的分离与观察
（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称6g于研钵中，加10ml 0.35mol/L NaCl溶液，用研钵捣碎成匀浆状。 (2)将匀浆用4层纱布过滤于50ml烧杯中。
(3)取滤液4ml于离心管中，在1000r/min下离心2min（注意离心前用天平配平）。 (4)将上清液倒入另一个干净的离心管中。
(5)将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(可能混有部分细胞核)，
(6)将沉淀用2 ml 0.35mol/L NaCl溶液悬浮（用滴管吹打沉淀使之悬浮）。 (7)用滴管取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后（用滤纸吸掉多余的液体）即可在普通光镜下观察（10×，40×，100×）。
(8)叶绿体悬液如果过浓，用0.35mol/L NaCl溶液稀释后重新制片观察。 2、菠菜叶切片观察
用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／L NaCl溶液，盖片后轻压，置普通显微镜下观察。 五、实验结果
1、画出高倍镜下的叶绿体图（多角度）；
2、说明0.35mol/LNaCl溶液的作用，是否可以蒸馏水代替。
实验五 掌握植物细胞骨架（微丝）的观察方法 一、实验目的：光镜下观察细胞骨架。 二、实验原理：
1、原理：在一定时间内，用适当浓度的TritonX-100(曲拉通X-100)处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮蓝R250染色，可在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。
2、细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。在细胞中支持和连接细胞各组份，与细胞运动有关的结构，包括微丝（MF）、微管（MT）、中间纤维。 3、TritonX-100：非离子型去垢剂，在一定时间内可消除细胞骨架外部杂蛋白，而骨架蛋白得以保留但长时间作用，也会破坏骨架蛋白。 4、M-缓冲液：增加膜稳定性，冲洗TritonX-100。 5、戊二醛：固定剂，使骨架蛋白变性，但网络形态不变。 6、考马斯亮兰R250：蛋白质染色剂（无选择特异性）。
三、试剂材料：M-缓冲液6mMol/L pH6.8；1% Triton X-100溶液 ； 2.5%戊二醛；0.2%的考马斯亮兰R250；PBS溶液；洋葱。 四、实验方法：
1.撕洋葱内表皮，置PBS液中，使之沉降3-4小时； 2.用镊子取几片处理好的洋葱内表皮，置于表面皿中；
3.用滤纸吸去PBS液，加入1%Triton x-100浸没，经常翻动洋葱内表皮。（处理时间15，17，19，21，23分钟）处理时每人选一个时间，处理结束后倒掉1%Triton x-100，用滤纸吸去多余液体。
4.加入适量的（达到完全浸泡）M-缓冲液，浸泡3-5分钟，倒掉液体。重复3次； 5.用滤纸吸去多余液体；
6.加入2.5%戊二醛浸泡0.5小时（轻轻翻动2次）； 7.倒掉液体。用滤纸吸去多余液体；
8. 加入适量的（达到完全浸泡）PBS缓冲液，浸泡3-5分钟，倒掉液体。重复3次；
9.用滤纸吸去多余液体；
10.加入适量的（达到完全浸泡）0.2%考马斯蓝染色液，染20分钟； 11.倒掉染色液。用滤纸吸去多余液体；
12.加入适量的（达到完全浸泡）蒸馏水，浸泡0.5分钟，倒掉液体。重复2次； 12.用镊子撕洋葱内表皮（大小约0.3×0.3cm），放在载玻片上，加盖片，在普通光镜下观察（10×，40×） 五、实验结果：
1、 绘出实验观察到的细胞骨架图； 2、 说明细胞骨架的作用；
实验六 细胞活力的测定
一、实验目的：学习鉴别细胞活力的方法。 二、实验材料及试剂
1、口腔上皮细胞，鼠肝细胞。
2、0.01%吖啶橙生理盐水溶液，0.05%苯胺黑生理盐水液 三、实验内容：
1、细胞活力鉴别：用牙签取口腔上皮细胞，涂于载玻片上，用0.01%吖啶橙染色，兰光激发，观察细胞活性与荧光强弱的关系。
3、 细胞死活鉴别：取鼠肝细胞悬液，滴一滴在载玻片上，加一滴苯胺黑染1-2
分钟，在普通光学显微镜下观察。 四、实验结果：记录实验现象并解释。
注：鼠肝悬液：头天取鼠肝用70%乙醇固定，冰箱保存，为死细胞，实验前取新鲜鼠肝、悬浮，为活细胞。观察物中死活细胞均有，用生理盐水悬浮。
1：细胞活力鉴别
实验步骤：用牙签取口腔上皮细胞，涂于载玻片上，0.01%吖啶橙染色约5分钟，兰光激发观察细胞活性与荧光强弱的关系。 2：细胞死活鉴别
实验步骤：取小鼠肝细胞悬液，滴一滴在载玻片上，加一滴苯胺黑染1-2分钟，观察。
实验七 荧光的细胞化学测定
一、实验目的：了解荧光显微技术的原理和方法，以及在细胞化学方面的应用。 二、实验原理：
1、荧光：当一种波长的光照射某种物质时，这种物质会在极短的时间内发出较入射光波长更长的可见光，这种被激发出的可见光叫做荧光。 ①自发荧光：有些生物体受到短波光照射后直接发出荧光； ②次生荧光：生物材料吸附荧光染料后，经短波光照射发出荧光；
2、荧光显微技术：用短波光照射被检物使其发出荧光，然后在荧光显微镜下镜检，观察荧光强弱，颜色分布，从而测定细胞活性，荧光物质的分布及某种结构的有无。 三、实验用品：
0.01% 吖啶橙生理盐水液（DNA专一染料）。 0.02%异硫氰酯荧光素（激发光源：蓝色发绿光）。
0.01%罗丹明生理盐水液（不是线粒体专一性染料，所以整个细胞都能被染色，而线粒体呈亮红色）。 四、实验内容：
1、DNA分布（核）的观察：
撕掉洋葱内表皮，吖啶橙（DNA专-性染料）染色5分钟，生理盐水冲洗，蓝光激发观察（冲洗方法：盐水一滴，吸掉，再一滴，观察） 2、蛋白质分布（细胞）的观察：
撕掉洋葱内表皮，异硫氰酯荧光素染5分钟，盐水一滴，吸掉，再一滴，观察，生理盐水冲洗，蓝光激发。 3、线粒体，细胞骨架观察：
撕洋葱内表皮，罗丹明溶液染5分钟，冲洗，绿光激发（整个细胞红色，靠细胞壁处有小红点为线粒体）。 五、实验结果：
分别说明实验结果（物质、结构、颜色及分布）。
1、 DNA分布观察：核呈亮绿色，其间可见相间的亮区或条纹呈亮绿色，细胞中
也有较亮的绿色条纹。
2、 蛋白质分布观察：液泡处暗，胞质部为亮绿色。
3、 线粒体的分布：整个视眼显红色，能观察出细胞的形态，红亮晶晶的红色小
点。