常见分子生物学实验

陈阳松

溶液稀释与配比

C1V1=C2V2:万能稀释公式,一般母液和终浓度比不为X:1用这个公式计算。X/1:当母液与终浓度比为X:1时用这个快速方法,此时方法为把母液分为1,剩下的用总比例减掉,如:X2(1:1), X6(1:5),X10(1:9)。

百分数和mol数转以1%盐浓度进行转换

换设是100克的此溶液,则有99克的水和1克的盐(NaCl),盐的物质的量为1/58.5=0.017mol,水体积为99mL=0.099L,所以物质的量浓度为0.017/0.099=0.17mol/L,即摩尔浓度为0.17mol/L

1%=1g/100g (1/58.5)/0.099

1. 各成分作用

CTAB法提取DNA

CTAB:溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离; Tris-HCl (pH8.0):提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性; NaCl:提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,在于液相中;

β-巯基乙醇:抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除;

PVP(聚乙烯吡咯烷酮):酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。

酚:使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。

氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层,去除核酸溶液中的迹量酚。 异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

2. 操作步骤

陈阳松

打样

新鲜叶片,转速220r/min,1min,打样时管身全部冻着,而且放在打样机的时候保证盒子里面得有液氮,这样样品才能充分打碎,写字的朝向一致,以便认字

提取

1) 称取0.1g(约3-4片)新鲜叶片,液氮中研磨成粉末,加入800ulCTAB缓冲液轻轻摇匀,65°C水浴(烘箱)保温30min左右; 备注

用2ml管提取时,加完CTAB在本子上记录好每个样品的名字,防止后面漏管和裂管时查找被抹掉的号,这样可以防止在侧壁写管的麻烦; 在等待的过程时,即可拿出1.5ml离心管加入异戊醇做好准备;写字的朝向一致,以便认字

2) 冷却(放冰箱)至室温后,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)盖上瓶盖,温和摇动,使成乳状液。 备注

一定要冷却,不然的话,热涨后盖子盖不紧,

此处必须摇匀,不然会因为分层不明显,表面容易起一层油状层; 3) (按照管盖的的朝向,在加完异戊醇的管上写上对应样品名字,字迹要大,以防相同的数字出现如81/18,以及即使掉了一些也还有一部分可以识别) 4) 8000rpm 10min ,离心管中出现三层,小心吸取含有DNA的上清液

(400-500ul)到新的1.5ml离心管中。根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇重复抽提1-2次; 备注

吸上清液时,按照前面写好的顺序,打开盖,同时打开异丙醇的盖,可以检查哪些漏掉,一旦发现漏掉的,立马盖上盖子,吸完别的后平躺着吸这管

吸上清时,枪头不要挨着最深处的上清液,挨着上面那个片层处吸,能吸多少吸多少

5) 在上清液中,加入0.7倍/等体积的异丙醇(400-500ul),颠倒混匀,放

-20入冰箱不少于20min;

陈阳松

备注:倒废液时,用空板一排一排倒

6) 8000rpm 离心10min,弃上清;加600ul的70%乙醇冲洗沉淀,轻摇几

分钟,8000rpm 离心5min,除去乙醇,即为DNA粗制品;

备注:倒扣在卫生纸上,可以干得更快,40min左右即可拿出,迅速加水溶解,37摇床,67r,1h

3. 注意事项

1) 吸取上清液时一定要小心,必要时减掉枪头顶端;

2) 在倒废液时,找一个管架,盖子打开后朝里侧将其尽量合拢,管口朝外,

扣住管架后,一起倒掉废液,这样可以避免液体毁掉管上的字; 3) 在盖盖时,拇指按住盖,找准方向按下去;

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