mmu-miR-125a-5p研究策略
micrON? mmu-miR-125a-5p mimic micrOFF? mmu-miR-125a-5p inhibitor, Standard 2ng 2ng 报价 Standard 报价 350 RMB 5ng 600 RMB 300 RMB 5ng 500 RMB ? 转染mmu-miR-125a-5p mimic(24孔板为例)
1．联系锐博公司合成mmu-miR-125a-5p mimic和mmu-miR-125a-5p
inhibitor;
2．合成的2ng mmu-miR-125a-5p mimic用1000ul RNase-free water配制成20uM的储存液,分装成5ul每管放-30或-80冻箱冻存(mimic的工作浓度为50nM);
3．转染前一天，胰酶消化细胞并计数1X105 c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;
4．对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic 存储液;
5．对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ无血清培养基稀释1μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后室温5分钟（在30分钟内同稀释的RNA混合。室温时间过长会降低活性。） 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合
6．混合稀释的RNA（第4步）和稀释的Lipofectamine 2000（第5步）。在室温保温20分钟。 注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定
7．直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀,加入500ul培养基,混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基
8．在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性
9．在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周.
实验优化:
① miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究的目的而异,锐博推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM,miRNA inhibitor的浓度为100nM,可以根据实验具体的情况优化转染的浓度,优化的范围为10-200nM
② 注:miRNA inhibitor往往需要用到较大的量才能观察到较好的抑制效果,相当于miRNA mimic的几倍用量,这可能与miRNA inhibitor抑制的作用机制及作用效率有关.因此,当使用推荐的转染浓度没有获得预期的效果时,可适当选择更高的浓度.