分子生物学实验教案2010

分子生物学实验教案

实验1 质粒DNA小量提取和纯化

【时间安排】:3学时 【实验类型】:基本训练

【目的要求】:

1、 了解:质粒DNA的一般特征特性和提取质粒的原理; 2、 掌握:最常用的提取质粒DNA的方法;

3、 熟悉:质粒DNA小量提取和纯化的方法步骤。

【实验原理】:

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,在基因工程中具有及其广泛的应用价值,因此,质粒的分离、提取和纯化是最常用、最基本的实验技术。

质粒(plasmid)是一种独立、稳定的遗传因子,是在细菌等细胞中染色体之外的DNA分子,大小范围在1~200kb以上不等。大多数来自细菌细胞的质粒是双链、共价闭合的环状分子,以超螺旋形式存在。作为理想的克隆载体的质粒必须具备以下四点:(1)一个复制起点(raplication origin);(2)一个或多个选择性标记基因,如抗生素基因;(3)带有一个人工合成的、含有多个限制性酶切位点的多克隆位点(Multiple cloning site, MCS);(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数。天然质粒存在不同程度的局限性,现在常用的质粒大多数都是经过修饰和改造过的质粒。

应用质粒作为基因克隆的载体分子,一个重要的条件是获得批量纯化的质粒DNA分子。带有质粒的宿主(如大肠杆菌)细胞中,除了质粒外,还有基因组DNA和各种RNA的存在,并且还含有菌体组分的蛋白质、脂类物质等。提取质粒就是从这些混合物中将质粒分离出来。已经建立了多种从细菌中提纯质粒DNA的方法,这些方法无一例外都包括以下三个步骤:(1)培养细菌,使质粒大量扩增;(2)收集和裂解细菌并除去蛋白质和染色体DNA;(3)分离和纯化质粒。

本实验是采用SDS裂解法制备质粒DNA。人们使用碱与SDS裂解法从E.coli中分离制备质粒DNA已有20多年的历史。其原理是:

将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清液中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏,闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离,这是因为它们在拓扑学上是相互缠绕。只要OH处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,DNA双链就会再次形成。在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,然后被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时,这些复合物会从溶液中沉淀下来。离心除去变性剂后,就可以从上清液中回收复性的质粒DNA。

SDS裂解法制备质粒DNA通常使用Solution Ⅰ、Solution Ⅱ、Solution Ⅲ三种溶液,其生化作用原理:

Solution Ⅰ:溶菌液,葡萄糖增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解;EDTA螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制Dnase对DNA的降解作用(因为Dnase作用时,需要一定的金属离子作辅基)。

Solution Ⅱ:核酸在pH大于5,小于9的溶液中是稳定的,当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在Solution Ⅱ中NaOH的浓度为0.2mol/L,加抽提液时,该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA和质粒DNA的变性;SDS是离子型表面活性剂,它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细

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胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3……R——蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。

Solution Ⅲ:NaAc的水溶液呈碱性,为了调节pH值至4.8必须加入大量的冰醋酸。所以Solution Ⅲ实际上是NaAc-HAc缓冲液。其作用是为了把pH12.6的抽提液中和,调pH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电贺,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。

【仪器与试剂】:

主要仪器:微量移液器、离心机、离心管、冰盒、恒温水浴锅、干燥器等。

主要试剂:LB培养基、抗生素、TE溶液、RNase溶液、NaAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、乙醇、缓冲液和溶液等

LB(Luria-Bertani)培养基:配制每升培养基,应在950ml去离子水中加入细菌培养用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g;细菌培养用酵母提取物(bacto-yeast extract)5g;NaCl 10g,充分溶解后用5mol/L NaOH调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L,在15 lbf/in(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌20分钟。少量配制应按比例减小! Solution Ⅰ:50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA(pH8.0) Solution Ⅱ:200mmol/L NaOH,1%(m/v)SDS(要现用现配,室温使用!) Solution Ⅲ:3mol/L KAc(pH4.8)溶液。可这样配制:

5 mol/L乙酸钾 60.0ml 冰乙酸 11.5ml H2O 28.5ml

混合

(所配成的溶液中钾离子浓度为3mol/L,乙酸根的浓度为5 mol/L。保存于4℃,用时置于冰浴中。) 其他溶液:

酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),酚可用可不用! NaAc:3mol/L

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【重要实验步骤和教学设计】:

1、 实验准备:制备含有相应抗生素的固体和液体LB培养基,将保存的菌液涂布到固体培

养基平板上培养单菌落(1~2天)。 2、 挑取单菌落在含有对应于某一抗生素(如Amp或Kan)的LB培养液(1.5mL)中接种,37℃振荡培养过夜,使细菌处于对数生长期(约12-16个小时)。 3、 吸取1.5mL培养液于eppendorf管中,12000rpm离心5分钟,弃去上清液,可用微量移液器适当吸取残余上清。细菌沉淀于管底。 4、 加入100μL溶液Ⅰ,用手指或涡旋振荡器剧烈弹震,使菌体充分悬浮,室温下静置5min。 5、 加入200μL新配制的溶液Ⅱ,盖紧管盖,上下温和颠倒eppendorf管2-3回,以混匀

内容物(千万不要剧烈振荡),冰浴静置5min。 6、 加入150μL浴冷的溶液Ⅲ,上下颠倒混匀数次,冰浴条件下静置5min。 7、 12000rpm离心10min,将上清液移至新的eppendorf管中(约400μL)。 8、 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分振荡混匀,12000rpm离心5min。

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9、 吸取上层水相至新的离心管中,加入十分之一体积量的3mol/L的pH5.2NaAc,再加入2倍体积(约1 mL)的预冷的无水乙醇。 10、 放入-20℃冰箱中静置30分钟,12000rpm离心15min。 11、 弃去上清,加入1mL预冷的70%乙醇,12000rpm离心5min,洗涤沉淀。 12、 弃去上清,沉淀在室温下自然干燥。然后加入40μLTE溶液。 13、 14、

取5μL的质粒与2μL的6X上样缓冲液混合后,在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳检测。 将所获得的质粒DNA样品置于4℃冰箱中备用。

【实验注意事项】:

1、 注意微量移液器、离心机的正确使用方法;

2、 在记入溶液Ⅱ时只需上下温和颠倒离心管即可,千万不能剧烈振荡。

3、 经抽提后,吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入,其中含有蛋白质等杂质。

【思考题】:

1、 作为理想的克隆载体的质粒必须具备哪些特点? 2、 SDS裂解法制备质粒DNA的原理是什么?

3、 SDS裂解法制备质粒DNA中三种溶液的生化原理分别是什么? 4、 除了SDS裂解法外,还有什么方法可以制备质粒DNA?

【实验后记】:

实验2 分光光度法测定DNA的浓度和纯度

【时间安排】:3学时 【实验类型】:基本训练 【目的要求】:

1、 了解:分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理; 2、 掌握:分光光度法测定DNA浓度和纯度的技术方法;

3、 熟悉:分光光度法测定DNA浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。

【实验原理】:

前面提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的,在后续的DNA酶切、连接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求,因此要测定DNA的浓度和纯度。

测定DNA的方法通常有:紫外分光光度法;琼脂糖凝胶电泳法(也叫荧光光度法) (1)紫外分光光度法:

组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性,最大吸收值在波长为250~270nm之间,腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm,胞嘧啶:267nm,鸟嘌呤:276nm,胸腺嘧啶:264.5nm,尿嘧啶:259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变,

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但核酸的最大吸收波长是260nm,吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下,10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为40μg/ml;单链寡聚核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

分光光度法不但能够确定核酸的浓度,还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8,RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8,说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况,所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA,或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。

(2)琼脂糖凝胶电泳法(荧光光度法):

对于很稀的核酸溶液,可以用琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光,它插入到DNA分子中形成荧光结合物,使发射的荧光增强几十倍,而荧光的强度正比于DNA的含量,将已知浓度的标准样品作为电泳对照,就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ng DNA即可,肉眼观察可检测0.05μg-0.1μg的DNA。该方法只是估计水平,另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。

【仪器与试剂】:

主要仪器:紫外分光光度计、石英杯、离心管、微量移液器; 主要试剂:实验1提取的质粒样品、纯水。

【重要实验步骤和教学设计】:

1、 吸取5μL DNA样品或4μL RNA样品,加水至1ml混匀后,转入分光光度计的石英比色

杯中。如果样品很少,可以用0.5ml的比色杯,上述核酸样品与水的用量缩小一半。 2、 先用1ml水对分光光度计校正为零点。

3、 在260nm和280nm分别读出光密度,DNA样品的浓度我OD260 × 核酸稀释倍数 ×

50/1000;RNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 40/1000;浓度单位为μg/μL。按

步骤1的稀释方式,DNA或RNA的浓度(μg/μL)均为OD260的10倍;如OD260为0.1,则样品的浓度就为1μg/μL DNA或RNA。这样稀释倍数非常便于计算。

4、 若为DNA样品,OD260/OD280比值大于1.8,说明仍存在RNA,可以考虑用RNA酶

处理样品;小于1.6,说明样品中存在蛋白质或酚,应再用酚/氯仿抽提,用乙醚抽提后,

以乙醇沉淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2,也应该考虑再用酚/氯仿抽提。

【实验注意事项】:

1、 使用石英杯时要注意拿取方法,不要直接拿透光的那两个侧面; 2、 测量前要调零,测量不同样品时要冲洗石英杯; 3、 正确开、关紫外分光光度计。

【思考题】:

1、 实验得出的数据是否合理?为什么?

2、 如果实验测得A260/A280=1.8,是否能说明提取的DNA样品非常纯净?为什么?

【实验后记】:

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