分子生物学实验教案
【重要实验步骤和教学设计】：
A 从琼脂糖凝胶中回收DNA
1、 通过琼脂糖凝胶电泳将目的片断与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含
需回收的琼脂块，放入1.5mL离心管中。判断DNA片断的位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间尽可能短。 2、 按400μL/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding BufferⅡ，置于50～60℃水浴中10分钟，
使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。 3、 将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ－10柱中，室温放置2分钟。
8000rpm室温离心1分钟。 4、 取下UNIQ－10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ－10柱放入到同一个收集管中，加
入500μLWash solution，8000rpm室温离心1分钟。 5、 重复步骤4一次。
6、 取下UNIQ－10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ－10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心15秒。 7、 将UNIQ－10柱放入一根新的1.5mL离心管中，在柱子膜中央加入40μL Elution Buffer
或水（ph>7.0）,室温或37℃放置2分钟。 8、 12000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片断，可立即使用或存放
于－20℃备用。
B 从溶液中回收DNA: 1
根据溶液的体积和所要回收的DNA的含量，加入3倍体积的Bingding BufferⅡ。如果溶液的体积不足50μL，加TE补足到50μL，再加入150μL Bingding BufferⅡ混匀。
2 以下同琼脂糖胶中回收DNA步骤3－8。
【实验注意事项】：
1、 挖取琼脂糖凝胶块时，要戴手套， 注意溴化乙锭（EB）的安全使用；
2、 加入Wash solution、Elution Buffer时，要对着滤膜滴加，又不要刺破滤膜；
3、 注意：对于高浓度的胶（1.5－2.0％），每100mg胶加入700μL Binding BufferⅡ，加热融
胶的时间可延长到15分钟，以保证全部融化。 4、 提高洗脱温度到55-80℃有利于DNA的洗脱效率。
【思考题】：
1、 在挖取琼脂糖凝胶块时为什么尽量减少不含目的DNA的凝胶？为什么尽量用长波长紫
外线，并且尽量减少紫外线的照射时间？ 2、 列举几个DNA回收的其他几种方法原理。
【实验后记】：
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分子生物学实验教案
实验7 目的基因与载体的体外连接
【时间安排】：3 学时 【实验类型】：基本训练
【目的要求】：
1、 了解：DNA连接酶的一般特性、连接反应条件和DNA连接方式；
2、 掌握：用T4 DNA在连接酶降载体与目的基因连接起来，构建体外重组DNA分子，同
时学习几种DNA连接的方法。 3、 熟悉：DNA连接反应所用的连接酶以及连接反应体系的构建。
【实验原理】：
DNA连接酶催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二脂键的形成，利用DNA连接酶将适当切割的载体DNA与目的基因DNA进行共价连接，就能构建重组DNA分子。
构建体外重组DNA分子一般是在T4 DNA连接酶的作用下，有Mg2+ATP存在的连接缓冲系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。 （一）DNA连接酶的作用步骤 1、T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物（腺苷酰酶）
2、酶-AMP复合物再结合到具有5′－磷酸基和3′－羟基切口的T4 DNA上，使DNA腺苷化。
3、产生一个新的磷酸二酸二脂键，把缺口封起来。 （二）DNA的连接方式
在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般讲是随机的，连接方式有：①自连；②两种片段相连；③三个片段以上的自连与互连，一般这种几率较少，但也有。可以通过对载体、目的基因的处理以控制和调整DNA的有效连接。如，通过控制载体DNA与目的DNA的分子比例，可以影响重组率。一般情况下，对分离片段来讲，载体DNA的摩尔数与目的基因的摩尔数之比为1︰5，但目的基因的比例太多，容易产生自连后插入载体的多聚体。连接体积太大，自连机会多。 （三）连接反应的条件
1、缓冲液含有Mg作为辅助因子，ATP提供能量，同时也有保护和稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）、BSA（小牛血清蛋白）。 2、温度：连接反应温度在37℃时有利于连接酶的活性，但该温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，一般为12～16℃。
3、时间：12～16h（过夜）或7～8℃2～3天。 （四）几种DNA连接方法
1、粘性末端连接法：即用专一性限制性内切酶酶切产生粘性末端，再通过DNA连接酶（T4DNA连接酶）进行体外连接。
2、平头末端连接法：是利用某些酶对DNA能切出平整的末端，然后利用T4DNA连接酶将两者连接。它要求DNA浓度高，酶用量比粘性末端的连接大20～100倍。
3、多聚核苷酸投影法：采用任一种限制性内切酶把DNA切开，利用DNA末端转移酶把互补的多聚核苷酸（poly A与poly T或poly G与poly C）连接到两者DNA片段的末端，然后用DNA聚合酶将其连接。
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4、人工街头（Waker）法：在要连接的外源基因与载体DNA的末端，先接上一段互补的人工接头，这个接头就是酶切酶的识别位点，因此可再用一种或二种限制性内切酶将其切开，产生粘性末端，再将外源基因与载体DNA连接。
【仪器与试剂】： 主要仪器：离心管、16℃培养箱、离心机、微量移液器、冰盒等。
主要试剂：酶切后的基因DNA片段和载体DNA片段、T4 DNA连接酶以及10倍的连接缓冲液。
【重要实验步骤和教学设计】：
1 在一个0.5mL的eppendorf管中加入2μL酶切后的载体与6μL目的基因片断。 2 添加1μL的10X连接buffer以及1μL的T4DNA连接酶
即 PCR产物 6μL 酶切质粒（pBSKS） 2μL 10X连接buffer 1μL T4DNA连接酶 1μL
总体积 10μL
3 混匀后3000rpm短暂离心将液体全部甩到管底。 4 16℃条件下保温过夜或4℃过夜。 5 连接产物用于转化感受态细胞。
【实验注意事项】：
1、 连接时外源基因量要多些，载体的量要少些，这样碰撞的机会就多些，否则载体自身环
化就比较严重。连接酶比较昂贵，酶的用量不要过多。 2、 连接反应需要ATP提供能量，在连接Buffer中含有ATP，所以尽量避免连接Buffer反
复冻融。
【思考题】：
1、 影响DNA体外连接的因素有哪些？ 2、 实验过程应注意什么问题？
【实验后记】：
实验8 大肠杆菌感受态细胞的制备
【时间安排】：3 学时 【实验类型】：基本训练
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分子生物学实验教案 【目的要求】：
1、 了解：制备大肠杆菌感受态细胞的原理；
2、 掌握：大肠杆菌感受态细胞的制备方法和技术； 3、 熟悉：制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤。
【实验原理】：
在原核生物中，转化是一种普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处在一种感受状态有很大的关系。所谓感受态是指细胞处于容易吸收外源DNA的状态，它是由受体菌的遗传性所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子等影响。
实验中通常使用氯化钙制备感受态大肠杆菌细胞。因为钙离子能够诱导大肠杆菌形成感受态细胞。对于钙离子诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间都是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12～24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。因此在制备感受态细胞时，将细胞培养至OD600为0.4～0.6后放入冰浴中使之停止生长，然后进行细胞处理。外界环境因子环腺苷酸（cAMP）及钙离子（Ca2+）能够提高受体细胞的感受态水平。另外，细胞的感受态一般出现在生长对数期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备感受态大肠杆菌的方法还有Hanahan方法（用于高效转化）和Inoue方法（用于制备超级感受态细胞）。
【仪器与试剂】：
主要仪器：离心管、三角瓶、摇床、超净工作台、冷冻离心机、冰盒、碎冰、微量移液器等。 主要试剂：LB培养基、大肠杆菌菌株、CaCl2溶液甘油等。
【重要实验步骤和教学设计】：
1、 从大肠杆菌DH10B平板上挑取一个单菌落接于2ml的LB液体培养基的试管中，37℃
振荡培养过夜。 2、 取0.5ml菌液转接到一个含有50ml的LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养2～3h，
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此时，OD60≤0.4～0.6，细胞数务必＜10/ml，此为实验关键
3、 将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。 4、 离心10min（4000r/min），回收细胞。
5、 倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。
6、 用冰冷的0.1mol/L 10ml悬浮沉淀，立即放在冰上保温30min。 7、 0～4℃，4000r/min，离心10min回收细胞。
8、 用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml悬浮细胞（务必放冰上）。 9、 分装细胞，每200μL一份。此细胞为感受态细胞。
【实验注意事项】：
1、 严格无菌操作，谨防杂菌污染。实验中凡是涉及溶液的转移、分装等需要敞开实验器具的操作，均应该在无菌超净工作台进行。
2、 细胞最好是从-70℃和-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 3、 所用的CaCl2应该是高纯度的。
4、 整个操作均需要在冰上操作，不要离开冰浴条件，否则细胞转化率将会降低。
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