分子生物学实验教案2010

分子生物学实验教案 【思考题】:

1、实验过程中应注意什么问题?

2、制备出来的感受态细胞在什么时候做转化最佳?

【实验后记】:

实验9 大肠杆菌感受态细胞的转化

【时间安排】:3 学时 【实验类型】:基本训练

【目的要求】:

1、 了解:转化大肠杆菌感受态细胞的原理;

2、 掌握:大肠杆菌感受态细胞的转化方法和技术; 3、 熟悉:转化大肠杆菌感受态细胞的实验步骤。

【实验原理】:

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌,并使细菌细胞的生物学特性发生可遗传的改变的过程。

用冰冷CaCl2溶液处理和短暂热休克处理是转化的常用方法,也是最便宜而简便的方法。其原理是当细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中时,菌体细胞膨胀造成球形,同时转化混合物中的DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经过42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长1小时后,球状细胞复原并分裂增殖,重组子中的基因在被转化的细菌中得到表达,再通过选择性培养基平板即可筛选出所需要的转化子。

转化的方法还有:Hanahan方法、Inoue方法、PEG法、电击法等等。

【仪器与试剂】:

主要仪器:超净工作台、离心机、42℃恒温水浴锅、37℃培养箱、离心管、三角瓶、摇床、冰盒、碎冰、微量移液器等。

主要试剂:感受态细胞、连接产物、LB培养基(含抗生素的培养基平板)、X-gal、IPTG等。

【重要实验步骤和教学设计】:

1、 1 制备含有Amp的LB培养基平板。

2、 取一管100μL的感受态细胞(如果是冰冻的则需要在冰上化冻后,进行操作),加入重

组质粒(质粒与目的基因)的连接产物5μL(不要超过5μL),轻轻用枪吹打均匀。 3、 置冰浴中20min。

4、 然后42℃保温90sec或37℃保温5min,迅速放入冰中,冰浴3-5min 5、 添加1mL 的LB培养基,37℃振荡培养1hou。

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分子生物学实验教案

6、 3000rpm离心5min,弃去上清,余下全部样品(约0.1μL)用枪轻轻吹匀,吸至含有Amp抗生素的LB培养基上,另添加20μL20mg/mL的X-gal和40μL100mmol/L的IPTG,均匀涂布。

7、 培养基正面放置37℃培养箱中30min后,倒置培养16个小时。

【实验注意事项】:

1、 进行转化时的质粒量应该是感受态细胞总量的1/10以下。

2、 IPTG是针对具有lacZ基因型的大肠杆菌诱导表达lacZ而添加的,而对于不具有lacZ

菌株则没有添加的必要。 3、 为了使蓝色菌落更明显,可以将培养基放于4℃冰箱中3hou。 4、 制备感受态细胞时一定要在冰上操作。

【思考题】:

1、 转化过程中要注意什么问题?

2、 为什么要先在不含有抗生素的液体培养基中培养一个小时,然后再涂布于含有抗生素的

平板上? 3、 除了热激转化外,还有什么转化方法?

【实验后记】:

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实验10 重组子的筛选

【时间安排】:3 学时 【实验类型】:基本训练 【目的要求】:

1、 了解:α互补原理以及其他筛选鉴定方法;

2、 掌握:通过本实验学会重组DNA(重组子)的筛选方法和技术; 3、 熟悉:重组DNA筛选的操作步骤。

【实验原理】:

重组质粒转化宿主细胞后,还需对转化菌落进行筛选,利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。

α互补是指E.coli β-半乳糖苷酶的两个无活性片段组合而成为功能完整的酶的过程。该酶是把乳糖切成葡萄糖和半乳糖的酶,该酶基因来自大肠杆菌LacⅠ基因,删去LacⅠ基因中编码起始甲硫氨酸的5′区,翻将从下游的甲硫氨酸开始,从而产生酶的C端片段。现用的许多载体都含有β-半乳糖苷酶的前146各个氨基酸的编码序列及其调控序列,即N端片段序列,其中在编码序列中包含着保持读框的多克隆位点,会在酶的N中引入少量不影响其功能的氨基酸。当在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导着氨末端片段,基β-半

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乳糖苷酶的合成,从而互补β-半乳糖苷酶缺陷的宿主。合成的β-半乳糖苷酶可将无色的X-gal切割城半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝,在培养基平板上就形成蓝色菌落。但在多克隆位点插入外源DNA时,导致β-半乳糖苷酶的氨末端失活(即LacⅠ基因表达中断),从而不能进行α互补,因此带有重组载体质粒的细菌产生白色菌落,即通过在X-gal平板上的蓝/白颜色筛选重组子。

除了α互补筛选法外,还有抗药性筛选法、营养缺陷型筛选法、电泳筛选法、PCR检测法、核酸碳针筛选法、DNA序列分析。

【仪器与基本操作】:

主要仪器:超净工作台、涂布工具、培养皿、恒温培养箱等。

主要试剂:LB培养基(含抗生素氨苄青霉素、卡那霉素)、X-gal、IPTG等。

【重要实验步骤和教学设计】:

1、 将含有重组子的并活化后的菌液均匀涂布于含Amp抗生素的并添加X-gal和IPTG的LB培养基上,培养至蓝/白斑出现。 2、 观察平板上长出的抗性菌落(转化子),有白色菌落和蓝色菌落,白色菌落可视为重组

子,蓝色菌落为非重组子。统计蓝、白斑的比例。

【实验注意事项】:

1、 转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素(氨苄青霉素、卡那霉素)的LB培养基中进

行培养,然后抽提质粒。抽提质粒所挑选的菌落必须是单菌落。 2、 菌落长出后可以放到4℃稍培养,增加显色。

【思考题】:

1、 α互补筛选重组子的原理是什么? 2、 白色菌落是否都是真正重组子?为什么?

【实验后记】:

实验11 PCR鉴定重组子

【时间安排】:3 学时 【实验类型】:验证 【目的要求】:

1、 了解:PCR鉴定重组子的方法原理;

2、 掌握:通过本实验学会PCR鉴定重组子的方法和技术; 3、 熟悉:PCR鉴定重组子的操作步骤。

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分子生物学实验教案 【实验原理】:

平板抗生素与蓝白斑筛选是非常重要,但并不精确,因为平板上许多菌落是假阳性的情况,如载体DNA缺失后自我连接引起的转化,非特异性片段插入组建载体的转化,而真正阳性重组体只有很小一部分。要确证外源目的基因片段插入载体,还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小。所以必须从转化子中鉴定出真正的重组子。PCR检测法是比较简便的方法。根据实验4,可以利用现有的引物,以含有重组子的菌液为模板,或先通过碱变性法提取质粒,再以质粒为模板,进行PCR扩增,检测构建质粒是否是所期望的重组质粒。

其他方法还有酶切鉴定法、核酸探针分子杂交法、DNA序列分析法等。

【仪器与基本操作】:

主要仪器:超净工作台、涂布工具、培养皿、恒温培养箱、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽等。

主要试剂:LB培养基(含抗生素氨苄青霉素、卡那霉素)、X-gal、IPTG、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA标准Marker等。

【重要实验步骤和教学设计】:

1、 按照蓝白斑筛选法,挑取白色单菌落接入1.5mL含抗生素的LB液体培养基中,37℃振

荡培养三个小时,取出2μL菌液作为模板进行PCR反应,反应体系其它成分同实验4。剩余菌液继续振荡培养至对数期,4℃保存备用。 2、 PCR产物电泳,以目的基因片断作为对照,确认出正确插入的重组质粒。

具体操作方法间实验3

【实验注意事项】:

1、 转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素(氨苄青霉素、卡那霉素)的LB培养基中进

行培养,然后再以菌液为模板,或抽提质粒,抽提质粒所挑选的菌落必须是单菌落。 2、 电泳操作中要注意溴化乙锭的安全使用方法。

【思考题】:

1、 以菌液做模板和以质粒做模板进行扩增有什么区别? 2、 还有什么方法可以鉴定重组子?

【实验后记】:

实验12 酶切鉴定重组子

【时间安排】:3 学时 【实验类型】:验证 【目的要求】:

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