分子生物学实验教案 【思考题】：
1、实验过程中应注意什么问题？
2、制备出来的感受态细胞在什么时候做转化最佳？
【实验后记】：
实验9 大肠杆菌感受态细胞的转化
【时间安排】：3 学时 【实验类型】：基本训练
【目的要求】：
1、 了解：转化大肠杆菌感受态细胞的原理；
2、 掌握：大肠杆菌感受态细胞的转化方法和技术； 3、 熟悉：转化大肠杆菌感受态细胞的实验步骤。
【实验原理】：
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌，并使细菌细胞的生物学特性发生可遗传的改变的过程。
用冰冷CaCl2溶液处理和短暂热休克处理是转化的常用方法，也是最便宜而简便的方法。其原理是当细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中时，菌体细胞膨胀造成球形，同时转化混合物中的DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经过42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在被转化的细菌中得到表达，再通过选择性培养基平板即可筛选出所需要的转化子。
转化的方法还有：Hanahan方法、Inoue方法、PEG法、电击法等等。
【仪器与试剂】：
主要仪器：超净工作台、离心机、42℃恒温水浴锅、37℃培养箱、离心管、三角瓶、摇床、冰盒、碎冰、微量移液器等。
主要试剂：感受态细胞、连接产物、LB培养基（含抗生素的培养基平板）、X-gal、IPTG等。
【重要实验步骤和教学设计】：
1、 1 制备含有Amp的LB培养基平板。
2、 取一管100μL的感受态细胞（如果是冰冻的则需要在冰上化冻后，进行操作），加入重
组质粒（质粒与目的基因）的连接产物5μL(不要超过5μL)，轻轻用枪吹打均匀。 3、 置冰浴中20min。
4、 然后42℃保温90sec或37℃保温5min，迅速放入冰中，冰浴3－5min 5、 添加1mL 的LB培养基，37℃振荡培养1hou。
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6、 3000rpm离心5min,弃去上清，余下全部样品（约0.1μL）用枪轻轻吹匀，吸至含有Amp抗生素的LB培养基上，另添加20μL20mg/mL的X-gal和40μL100mmol/L的IPTG，均匀涂布。
7、 培养基正面放置37℃培养箱中30min后，倒置培养16个小时。
【实验注意事项】：
1、 进行转化时的质粒量应该是感受态细胞总量的1/10以下。
2、 IPTG是针对具有lacZ基因型的大肠杆菌诱导表达lacZ而添加的，而对于不具有lacZ
菌株则没有添加的必要。 3、 为了使蓝色菌落更明显，可以将培养基放于4℃冰箱中3hou。 4、 制备感受态细胞时一定要在冰上操作。
【思考题】：
1、 转化过程中要注意什么问题？
2、 为什么要先在不含有抗生素的液体培养基中培养一个小时，然后再涂布于含有抗生素的
平板上？ 3、 除了热激转化外，还有什么转化方法？
【实验后记】：
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实验10 重组子的筛选
【时间安排】：3 学时 【实验类型】：基本训练 【目的要求】：
1、 了解：α互补原理以及其他筛选鉴定方法；
2、 掌握：通过本实验学会重组DNA（重组子）的筛选方法和技术； 3、 熟悉：重组DNA筛选的操作步骤。
【实验原理】：
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选，利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。
α互补是指E.coli β-半乳糖苷酶的两个无活性片段组合而成为功能完整的酶的过程。该酶是把乳糖切成葡萄糖和半乳糖的酶，该酶基因来自大肠杆菌LacⅠ基因，删去LacⅠ基因中编码起始甲硫氨酸的5′区，翻将从下游的甲硫氨酸开始，从而产生酶的C端片段。现用的许多载体都含有β-半乳糖苷酶的前146各个氨基酸的编码序列及其调控序列，即N端片段序列，其中在编码序列中包含着保持读框的多克隆位点，会在酶的N中引入少量不影响其功能的氨基酸。当在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导着氨末端片段，基β-半
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分子生物学实验教案
乳糖苷酶的合成，从而互补β-半乳糖苷酶缺陷的宿主。合成的β-半乳糖苷酶可将无色的X-gal切割城半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝，在培养基平板上就形成蓝色菌落。但在多克隆位点插入外源DNA时，导致β-半乳糖苷酶的氨末端失活（即LacⅠ基因表达中断），从而不能进行α互补，因此带有重组载体质粒的细菌产生白色菌落，即通过在X-gal平板上的蓝/白颜色筛选重组子。
除了α互补筛选法外，还有抗药性筛选法、营养缺陷型筛选法、电泳筛选法、PCR检测法、核酸碳针筛选法、DNA序列分析。
【仪器与基本操作】：
主要仪器：超净工作台、涂布工具、培养皿、恒温培养箱等。
主要试剂：LB培养基（含抗生素氨苄青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG等。
【重要实验步骤和教学设计】：
1、 将含有重组子的并活化后的菌液均匀涂布于含Amp抗生素的并添加X-gal和IPTG的LB培养基上，培养至蓝/白斑出现。 2、 观察平板上长出的抗性菌落（转化子），有白色菌落和蓝色菌落，白色菌落可视为重组
子，蓝色菌落为非重组子。统计蓝、白斑的比例。
【实验注意事项】：
1、 转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素）的LB培养基中进
行培养，然后抽提质粒。抽提质粒所挑选的菌落必须是单菌落。 2、 菌落长出后可以放到4℃稍培养，增加显色。
【思考题】：
1、 α互补筛选重组子的原理是什么？ 2、 白色菌落是否都是真正重组子？为什么？
【实验后记】：
实验11 PCR鉴定重组子
【时间安排】：3 学时 【实验类型】：验证 【目的要求】：
1、 了解：PCR鉴定重组子的方法原理；
2、 掌握：通过本实验学会PCR鉴定重组子的方法和技术； 3、 熟悉：PCR鉴定重组子的操作步骤。
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分子生物学实验教案 【实验原理】：
平板抗生素与蓝白斑筛选是非常重要，但并不精确，因为平板上许多菌落是假阳性的情况，如载体DNA缺失后自我连接引起的转化，非特异性片段插入组建载体的转化，而真正阳性重组体只有很小一部分。要确证外源目的基因片段插入载体，还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小。所以必须从转化子中鉴定出真正的重组子。PCR检测法是比较简便的方法。根据实验4，可以利用现有的引物，以含有重组子的菌液为模板，或先通过碱变性法提取质粒，再以质粒为模板，进行PCR扩增，检测构建质粒是否是所期望的重组质粒。
其他方法还有酶切鉴定法、核酸探针分子杂交法、DNA序列分析法等。
【仪器与基本操作】：
主要仪器：超净工作台、涂布工具、培养皿、恒温培养箱、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽等。
主要试剂：LB培养基（含抗生素氨苄青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA标准Marker等。
【重要实验步骤和教学设计】：
1、 按照蓝白斑筛选法，挑取白色单菌落接入1.5mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃振
荡培养三个小时，取出2μL菌液作为模板进行PCR反应，反应体系其它成分同实验4。剩余菌液继续振荡培养至对数期，4℃保存备用。 2、 PCR产物电泳，以目的基因片断作为对照，确认出正确插入的重组质粒。
具体操作方法间实验3
【实验注意事项】：
1、 转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素）的LB培养基中进
行培养，然后再以菌液为模板，或抽提质粒，抽提质粒所挑选的菌落必须是单菌落。 2、 电泳操作中要注意溴化乙锭的安全使用方法。
【思考题】：
1、 以菌液做模板和以质粒做模板进行扩增有什么区别？ 2、 还有什么方法可以鉴定重组子？
【实验后记】：
实验12 酶切鉴定重组子
【时间安排】：3 学时 【实验类型】：验证 【目的要求】：
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