园林植物遗传育种学实验指导书
实验四 园林植物花粉采集与保存
一、实验目的
通过本实验让学生学习掌握花粉采集与保存的基本方法，同时进一步认识园林植物花器官的结构特点。 二、实验原理
在有性杂交育种中，常常父母本花期不遇，作为父本的花粉必须经过贮藏直到母本植株开花时再用于授粉；或者双亲不在一个地方，必须由外地邮寄花粉供应，因此在育种工作中常常需要采集和贮藏花粉，以满足生产需要。花粉贮藏的原理就是创造代谢强度底的环境，以延长花粉有寿命。 三、材料及用具
材料：百合、风信子、仙客来等
用具：镊子、硫酸纸、干燥器、冰箱、凡士林等。 四、实验内容 1.花药的采集
通常于晴天早晨露水干后，在选定的父本植物上选取当天盛开的花，用镊子将花药筒取出，或者将花朵置于油漆光滑的桌面上，用手轻轻揉搓花朵，然后过筛，取得花药； 2.几种花药简易烘干方法
自然晾干法：选择有暖气或火炉、室温在20~25℃的干燥空室，在室内放几张桌子，上面铺上光滑白纸，将花药平铺于白纸上，越薄越好，使其自然晾干。采用此法一般两天内即可晾干，干后轻轻搓碎花药，散出花粉，就可进行人工授粉。
火炉烘干法：此法同火炕烘干法基本一致，不同之处是热源不是火炕而是在房中间生一火炉，把花药摊放在炉子周围(但不能离炉子太近)。
电灯烘干法：此法用于较少花粉的制取。先准备一个纸箱，纸箱上部吊一个25W的白炽灯泡，箱的底部放花药和温度计，通过调节灯的高度来控制箱内温度。此法简单易行，适用于花粉用量少的个体果园。
干燥器法：将取出的花药放入干燥器内干燥2~4h 后，将花药取出放在培养皿中，压碎后将花粉过筛装入指形管中备用。 3.花药烘干时应注意的问题
(1) 温度：温度是影响花药烘干质量的最重要的因素，温度过高则花粉发芽率低，出粉量少；过低则烘干所用时间长。适宜的烘干温度为20~25℃，且要求温度相对稳定。
(2) 时间：在保持20~25℃的温度下，烘干36h左右。
(3) 切忌在阳光下曝晒花粉，据试验报道晒干的花粉发芽率仅为10%~20%，而晾干、烘干的花粉发芽率可达50%。
(4) 如果父本的花期晚，则需进行催花，对木本植物如苹果、梨等可以将花枝采回室内插瓶(称为切枝水培)，在温暖的条件下提前开花，然后按照上述方法取其花粉备用。
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4.花粉的保存
(1) 将采来的花粉进行干燥：晾干或放入盛有氯化钙的干燥器中初步干燥。 (2) 将干燥的花粉装在指形管中，不要太多，一般以五分之一或更少为宜，瓶口塞以纱布，瓶外贴以标签，注明种类、日期。
(3) 指形管放入有无水氯化钙控制湿度的干燥器中，干燥器放于温度为0~2℃的冰箱内。 五、思考题
1、百合、风信子、仙客来等植物的花器官结构有何特点？ 2、为什么要进行花粉贮藏？
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实验五 花粉生命力的测定
一、 实验目的与要求
掌握了解花粉生命力鉴定的方法及原理。
二、实验原理
花粉在低温（0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。 花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。
三、实验材料与设备
实验材料：牡丹、凤仙花、柳树等植物的花粉。
仪器及药品：载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、毛笔、干燥器、小指形管、标签、记号笔、显微镜、天平、烧杯、培养皿、滴管、玻璃棒、量筒、电炉、石棉网、冰箱； 凡士林、无水氯化钙、蔗糖、琼脂、蒸馏水、硼酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碘、碘化钾、氯化二苯基四氮唑（ TTC ）。
四、实验方法
1、直接测定法 将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。
2、形态观察法 直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。
3、染色观察法 1）碘－碘化钾染色法：以碘－碘化钾溶液（ 0.3g 碘＋ 1.3g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水）染色后于显微镜下观察，花粉被染成蓝色者表示具有生活力，花粉呈黄褐色者不具有生活力。 2） TTC 染色法： TTC 染色是一种鉴定去氢酶活性的组织化学反应，凡具有生活力的花粉在其呼吸过程中都有氧化还原作用，当 TTC 渗入有活力的花粉时，其去氢酶在催化去氢过程中与 TTC 结合，使无色的 TTC 变成 TTF 而
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呈现红色。
4、培养基发芽法 在培养基上进行花粉的人工萌发，鉴定待测花粉萌发率的高低。此法若采用适宜的培养基能较精确地测定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌发条件存在较大的差异，所以很多时候测定的结果也只是相对可靠。
五、实验步骤
花粉生活力的测定：
（1）染色观察法 ——TTC 染色法
①配制TTC 染色液：称取0.5gTTC溶于100ml 磷酸盐缓冲液（ 100ml 蒸馏水中溶解 0.832g Na2HPO42H2O和0.273g KH2PO4 ， pH7.2 ）中，装入棕色瓶备用。 ②制片：取少量花粉于载玻片上，滴入1～2 滴0.5％TTC 染色液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，于35～40℃条件下净置15～20min 。
③ 观察统计：在显微镜下观察三个不同的视野，凡被染成红色或玫瑰红的都是有生活力的花粉，黄色或不着色者为没有生活力的花粉。 （２）培养基发芽法 —— 固体培养基
①配制培养基：称取1g琼脂， 5g蔗糖，量取94ml 蒸馏水，装入烧杯，加热使琼脂融化呈透明状（注意补充水分，以保持培养基的浓度），即配成5%浓度的培养基。同法配制10%、15%、20%浓度的培养基。
②制片：用滴管吸取少量培养基，趁热滴在载玻片的凹槽内，放置片刻，使其凝固。 ③播种花粉：将少量花粉均匀地撒播在培养基上，注意不可过多，否则难以观察。 ④培养与观察：将制备好的片子放在垫有湿润滤纸的培养皿内，于20～22℃的温箱中培养；待花粉萌发后于显微镜下观察并统计发芽率。观察时每片随机取三个视野，统计花粉总数及发芽数，计算平均萌发率（花粉总数不少于 100 粒）。
六、作业
１、按下表统计实验结果。 染色法测定结果记载表
各视野中花粉粒数量及生活力 花粉来源 花粉其中 花粉其中 花粉其中 平均生活总数 红色 黄色 生活总数 红色 黄色 生活总数 红色 黄色 生活力14
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力
培养基法测定结果记载表
各视野中花粉粒数量及发芽率 花粉培养基1 来源 浓度 发芽数/总数
发芽率 2 发芽数/总数 力 力 (％) 3 发芽率 发芽数/总数 发芽率 平均生活力(％)
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