西南科技大学本科生毕业论文
第1章 绪 论
1.1 熊果苷概述
1.1.1 熊果苷及其资源分布
熊果苷（Arbutin），又名熊果甙、熊果素、熊果叶甙、熊果酚甙或杨梅甙，化学名为对羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-Hydroxyphenyl-β-D-glucopyranoside），熊果苷最初应用于药物中，有抗菌消炎的作用。自上世纪80年代，研究发现熊果苷作为酪氨酸酶的竞争抑制剂，能抑制黑色素形成过程中关键酶酪氨酸酶的活性，因此有美白的效果。是目前国际上极为流行的新型美白添加剂。其毒害性、刺激性、致敏性等副作用均较对苯二酚（氢醌）小，在护肤用品方面有广泛的用途[1-4]。
熊果苷最早在杜鹃花科熊果属的多年生小灌木植物熊果的叶子中被发现的。熊果植株高15厘米左右，叶子形小，革质，有光泽，叶长10~25mm，阔5~12mm，叶子的上表皮呈棕绿色，下表皮呈较淡的灰绿色。熊果叶子呈倒卵形，叶尖呈圆形，基部渐狭窄，形成极短的叶柄，叶子有强烈的收敛味和微苦的口感。该属植物主要分布于西欧、北美一带[1]，国内未有其分布的报道。熊果苷在熊果叶子中的含量一般占叶子干重的7%~9%，在熊果叶子中一般和甲基熊果苷相伴存在[5]。
除了在熊果叶子中有熊果苷的存在外，在鸡屎藤、越桔、虎耳草、沙梨树等植株中也发现有熊果苷的存在。这些植物在我国有大量分布[5]。 1.1.2 熊果苷的理化性质
熊果苷的物理性状为白色针状结晶或粉末，有两种差相异构体，即α及β型，化学名分别为4-羟基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、4-羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷。分子式C12H1607；分子量272.25；分子结构如图1-1所示。
图1-1 熊果苷的分子结构
熊果苷易溶于水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液，不溶于乙醚、氯仿、
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石油醚等。熔点198~201℃。熊果苷在酸性条件下不稳定，易被水解。熊果苷可与来自动植物矿物、经化学合成和人工复合的脂肪性、类脂性组份，如脂、富脂、酯蜡、脂酸、脂醇、甾醇、多羟基醇的单或双脂酸脂、甾醇脂酸酯、烷烃化学结构的油脂蜡、环链状聚二甲基硅氧烷，以及油脂性的色素、维生素、防腐组份、抗自动氧化组份等等，不相干扰。熊果苷的水溶液与低铁或高铁生成水溶性的浅黑色络合物，可和碱式乙酸铅发生沉淀反应。在配方中添加适量（一般为1％~3％）的维生素E对其有稳定作用，在配方中加入适量亚硫酸氢钠可防止膏体变色。
1.2 熊果苷的应用
1.2.1 利尿抗炎抗菌作用
含熊果苷的传统中药常用于治疗气管炎、感染性泌尿系统疾病、皮肤病、过敏及炎症性疾病。日本药典将熊果叶作为有抗菌消炎作用的生药收入。德国医用委员会推荐熊果汁作为尿道炎症的治疗药，但纯的熊果苷的效果不佳[6]。
王佩等人[7]报道熊果苷对福氏全佐剂诱发的大鼠原发性及继发性足肿胀具有抑制作用；对噁唑酮引起的小鼠两耳肿胀有抑制作用且使血中CD4+T细胞明显降低；可减少炎症组织PGE2水平及抑制大鼠腹腔巨噬细胞释放IBL4。分析熊果苷的抗炎效果可能与抑制炎症介质PGE2及IBL4释放有关。 1.2.2 镇咳、平喘、祛痰作用
熊果苷灌胃可增加动物气管分泌、延长氨水引咳潜伏期 、咳嗽次数减少、气管酚红排泌量明显增多[8]。 1.2.3 美白作用
熊果苷具有美白的作用且由于熊果苷的水溶性好，配伍方便，保湿性强，因此可作为化妆品中的美白剂。使用添加熊果苷的化妆品后，肤感柔和而舒适，皮肤外表有微白净感，得到广泛应用。国内外市场需求十分巨大[9]。上世纪90年代日本资生堂公司首先应用熊果苷于美白类化妆品中。
决定人类肤色的主要因素是黑色素，黑色素是由存在于表皮内的色素细胞合成的
[10]
。其生成原理如图1-2所示。
人体内的酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下生成多巴，多巴在酪氨酸酶催化作用下氧
化生成多巴醌，多巴醌生成多巴色素，经过一系列反应，以不同的途径生成黑色素。若阻断黑色素生成途径，则可具有美白作用。
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图1-2 黑色素生成机理
熊果苷能迅速渗入肌肤，在不影响细胞增殖浓度的同时，能有效抑制皮肤中的酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的生成。它通过自身与酪氨酸酶直接结合，竞争多巴的结合位点，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积。用250mg剂量作用人
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的皮肤模型发现，细胞的分化生长没有变化，但黑色素的生成比对照组减少60％[11]。Maeda等报道[12]，熊果苷对酪氨酸羟化酶活性亦有竞争性抑制作用，但不减少体外培养的黑素细胞中酪氨酸酶的蛋白含量及其mRNA水平。Chakraborty等研究发现[13]，熊果苷对黑素细胞酪氨酸酶家族的3种酶：酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白-1和酪氨酸酶相关蛋白-2的含量及分子大小均无影响，认为熊果苷是在转录后阶段抑制酪氨酸酶的活性。Curto等[14]提出理想的脱色素药物应具备的标准，即在抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的浓度下，对细胞活力和增殖力影响很小。Funayama等[15]比较β-熊果苷与其差相异构体（α-熊果苷）对来自蘑菇及小鼠黑素瘤酪氨酸酶活性的影响，结果表明，β-熊果苷抑制来自蘑菇及小鼠黑素瘤的酪氨酸酶。α-熊果苷仅抑制小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，其机理推测为混合型抑制，而β-熊果苷的机制是非竞争性的。α-熊果苷抑制强度为β-熊果苷的10倍。Nishimura等[16]也比较了β-熊果苷与α-熊果苷对黑素合成的抑制作用，用培养的B16黑色素瘤细胞研究两个化合物对黑色素合成的抑制作用，发现α-熊果苷和β-熊果苷对酪氨酸酶抑制作用水平相等，但浓度为1mmol／L的α-熊果苷未见抑制细胞的生长，而β-熊果苷在同样浓度则出现有效的抑制。显然，α-熊果苷比β-熊果苷具有更高的安全性。以上结果表明，熊果苷抑制了酪氨酸酶活性，但不影响酪氨酸酶的表达和合成，是一种理想的脱色素药物[17]。
1.3 熊果苷的制备
目前熊果苷的主要制备方法有：天然产物提取法、植物组织培养法、化学合成法和酶转化法。 1.3.1天然产物提取法
该法主要以天然药用植物为原料，利用有机溶剂提取、萃取、柱层析等分离纯化手段，得到熊果苷提取物。
熊果苷在熊果叶中的含量低，分离步骤繁多，提取物中熊果苷的纯度不高，故经济应用价值不大。但是由于现代人追求纯天然绿色化妆品的理念，仍然有一些厂家从植物提取天然熊果苷，作为高档美白化妆品中的添加剂。其主要利用铅盐法[18]。这种生产方式的一般步骤是：含熊果苷的植物叶子采集加工→用乙醇或水作萃取→将萃取液过滤，并将过滤物洗涤，合并滤液→将滤液用饱和的中性乙酸铅水溶液处理，沉淀其中的有机酸、酚酸、鞣酸、黄酮类等成分，生成不溶性铅盐沉淀→滤出沉淀，滤液用碱性铅水溶液使熊果苷生成非水溶性铅盐沉淀→滤出沉淀，悬浮于蒸馏水中，向悬浮液通入硫化氢气体，生成胶态的硫化铅沉淀，调节pH，防止熊果苷水解→将硫化
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铅胶状沉淀用抽滤法抽出，滤物水洗，合并滤液→将滤液减压浓缩，即可离析出满足化妆品之需的熊果苷晶体。
也可采用柱层析法。利用大孔吸附树脂分离等现代分离手段，从萃取液中得到熊果苷。
1.3.2 化学合成法
最早关于熊果苷化学合成的报道是应用溴化银，喹啉为催化剂，溴代四乙酰葡萄糖与氢醌单苄酯缩合，再经脱乙酰基和苯甲酰基制得熊果苷。该方法由于试剂较贵，反应步骤较多，已不常用[19]。
目前该法主要以葡萄糖与氢醒为原料，通过化学法合成熊果苷。化学合成法采用经典的Koenigs- Knorr反应，即将葡萄糖乙酰化再经过溴取代后得到溴代四乙酰葡萄糖，然后再与单侧链保护氢醌在碱性催化剂作用下缩合得到五乙酰葡萄糖，脱乙酰基得到熊果苷。反应过程如图1-3所示。
图1-3 熊果苷化学合成路线
李雯等人[20]报道用相转移催化剂合成熊果苷。该方法利用溴代四乙酰葡萄糖与单乙酰氢醌，经相转移催化得到五乙酰熊果苷，再经甲醇钠-甲醇体系脱保护基后得到熊果苷。该方法的关键步骤是单乙酰氢醌的合成，控制反应体系中氢醌与乙酸酐的物料比，是反应成功的关键。
化学法合成熊果苷都需要加保护基团和脱保护基团的步骤。但是利用化学法合成相对而言收率较高，成本较低，是市场上大部分熊果苷的来源。 1.3.3 酶转化法
该法主要以糖基转移酶或糖苷酶作为催化剂，通过转糖基反应或逆水解反应合成熊果苷。 1. 转榶基反应
Glycosyl-OR1+R2OH?Glycosyl-OR2+H-OR1
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