肽黄金检测方法
一、胰蛋白酶抑制因子的测定 (一)材料:
1、Tris buffer溶液:溶解6.050g羟甲基氨基甲烷(tris)和2.940g Cacl2·H2O于900.00ml水中,用4.00mol/L HCl调整pH至8.20, 再用水稀释至1000ml。
2、BAPA溶液:0.040g的苯甲酰-DL-精氨酸-Β-硝基替苯氨(BAPA)盐酸盐(Sigma公司产品)溶于1.00ml二甲基亚砜中,用预热到37℃的Tris buffer溶液稀释到100ml。
3、猪胰蛋白酶溶液:称取0.200g猪胰蛋白酶(Sigma公司产品)溶于20.00ml 0.001mol/L HCl作为储备液;取2.00ml储备液用Tris buffer溶液稀释至100ml。
4、30%醋酸溶液:量取30.00ml冰醋酸用水稀释至100ml。 (二)样品制备:
在50ml试管中称入过80目筛的豆粕0.200g,并加入10.00ml水,在涡旋搅拌器上搅拌3min,然后加入10.00ml Tris buffer溶液。室温下静止10min,待大部分固体絮状物质凝集下来后用滤纸过滤(豆粕样品提取液再用Tris buffer溶液稀释40或20倍)。 (三)反应:
1、样品空白和试剂空白:分别将1.00ml样品稀释液和2.00ml蒸馏水加入10ml试管中。在37℃下保温20min,各加入2.50ml和5.00ml BAPA溶液,混合后在37 ℃下保温10min,分别加入0.50ml和1.00ml 30%醋酸溶液中止反应,混合均匀后各加入1.00ml和2.00ml 用Tris buffer溶液稀释的猪胰蛋白酶溶液。
2、样品和标准:分别吸取1.00ml Tris buffer溶液(作标准)和3份1.00ml稀释液于10ml试管内,加入2.50ml BAPA溶液后在37℃下保温20min,加入1.00ml猪胰蛋白酶溶液,然后在水浴中保温10min,再加0.50ml 30%醋酸溶液中止反应。 (四)测量:
在385nm(或410nm)下用试剂空白校零和测定标准、样品和样品空白的吸光值,计算每ml稀释液读数减去其空白读数之后与标准读数之间的差值。规定吸光值减少0.01为1个胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)。
胰蛋白酶抑制剂含量TIU/g=2×〔(样品OD385nm -样品空白OD385nm)-标准液
OD385nm〕×稀释倍数N/〔(-0.01)×0.2〕
二、大、中、小分子蛋白质含量的测定
(一)原理:高分子含氮物质在酸性溶液中,易为单宁沉淀。而磷钼酸可同时沉淀高、中分子含氮物质,低分子含氮物则不为上述物质所沉淀。因此,测定单宁沉淀样品后滤液的含氮量,用总氮减去此值即得到高分子氮。再测磷钼酸沉淀样品后所得滤液的含氮量,即为低分子氮。用单宁沉淀样品所得滤液的含氮量减去低分子氮,即为中分子氮。 (二)试剂:
1、H2SO4:比重1.40;
2、单宁溶液:16.000g单宁溶于100.00ml水; 3、钼酸钠溶液:50.000g钼酸钠溶于100.00ml水。 (三)操作:
1、先测总氮,其总氮值记为W; 2、用单宁沉淀:
加一定量的样品(含80.0mg 左右的氮)于200ml的容量瓶中,加水到180.00-185.00ml,加比重1.40的H2SO4 4.00ml,摇匀。
置于20℃水浴中,保温15-20min,加10.00ml单宁液,加水到刻度,摇匀,立即用折叠滤纸过滤,此滤液可重复过滤,直至滤清。
取滤液50.00ml,测氮,其含氮值记为X。 3、用磷钼酸沉淀:
加一定量的样品(含80.0mg 左右的氮)于200ml的容量瓶中,加水到175.00ml左右,加10.00ml钼酸钠溶液,摇匀。
置于20℃水浴中,保温15-20min,加10.00ml比重1.40的H2SO4,加水到
刻度,摇匀,立即用折叠