肽黄金检测方法
一、胰蛋白酶抑制因子的测定 （一）材料：
1、Tris buffer溶液：溶解6.050g羟甲基氨基甲烷（tris）和2.940g Cacl2·H2O于900.00ml水中，用4.00mol/L HCl调整pH至8.20, 再用水稀释至1000ml。
2、BAPA溶液：0.040g的苯甲酰-DL-精氨酸-Β-硝基替苯氨（BAPA）盐酸盐（Sigma公司产品）溶于1.00ml二甲基亚砜中，用预热到37℃的Tris buffer溶液稀释到100ml。
3、猪胰蛋白酶溶液：称取0.200g猪胰蛋白酶（Sigma公司产品）溶于20.00ml 0.001mol/L HCl作为储备液；取2.00ml储备液用Tris buffer溶液稀释至100ml。
4、30％醋酸溶液：量取30.00ml冰醋酸用水稀释至100ml。 （二）样品制备：
在50ml试管中称入过80目筛的豆粕0.200g，并加入10.00ml水，在涡旋搅拌器上搅拌3min，然后加入10.00ml Tris buffer溶液。室温下静止10min，待大部分固体絮状物质凝集下来后用滤纸过滤（豆粕样品提取液再用Tris buffer溶液稀释40或20倍）。 （三）反应：
1、样品空白和试剂空白：分别将1.00ml样品稀释液和2.00ml蒸馏水加入10ml试管中。在37℃下保温20min，各加入2.50ml和5.00ml BAPA溶液，混合后在37 ℃下保温10min，分别加入0.50ml和1.00ml 30％醋酸溶液中止反应，混合均匀后各加入1.00ml和2.00ml 用Tris buffer溶液稀释的猪胰蛋白酶溶液。
2、样品和标准：分别吸取1.00ml Tris buffer溶液（作标准）和3份1.00ml稀释液于10ml试管内，加入2.50ml BAPA溶液后在37℃下保温20min，加入1.00ml猪胰蛋白酶溶液，然后在水浴中保温10min，再加0.50ml 30%醋酸溶液中止反应。 （四）测量：
在385nm（或410nm）下用试剂空白校零和测定标准、样品和样品空白的吸光值，计算每ml稀释液读数减去其空白读数之后与标准读数之间的差值。规定吸光值减少0.01为1个胰蛋白酶抑制剂单位（TIU）。
胰蛋白酶抑制剂含量TIU/g＝2×〔（样品OD385nm －样品空白OD385nm）－标准液
OD385nm〕×稀释倍数N/〔（－0.01）×0.2〕
二、大、中、小分子蛋白质含量的测定
（一）原理：高分子含氮物质在酸性溶液中，易为单宁沉淀。而磷钼酸可同时沉淀高、中分子含氮物质，低分子含氮物则不为上述物质所沉淀。因此，测定单宁沉淀样品后滤液的含氮量，用总氮减去此值即得到高分子氮。再测磷钼酸沉淀样品后所得滤液的含氮量，即为低分子氮。用单宁沉淀样品所得滤液的含氮量减去低分子氮，即为中分子氮。 （二）试剂：
1、H2SO4：比重1.40；
2、单宁溶液：16.000g单宁溶于100.00ml水； 3、钼酸钠溶液：50.000g钼酸钠溶于100.00ml水。 （三）操作：
1、先测总氮，其总氮值记为W； 2、用单宁沉淀：
加一定量的样品（含80.0mg 左右的氮）于200ml的容量瓶中，加水到180.00-185.00ml，加比重1.40的H2SO4 4.00ml，摇匀。
置于20℃水浴中，保温15-20min，加10.00ml单宁液，加水到刻度，摇匀，立即用折叠滤纸过滤，此滤液可重复过滤，直至滤清。
取滤液50.00ml，测氮，其含氮值记为X。 3、用磷钼酸沉淀：
加一定量的样品（含80.0mg 左右的氮）于200ml的容量瓶中，加水到175.00ml左右，加10.00ml钼酸钠溶液，摇匀。
置于20℃水浴中，保温15-20min，加10.00ml比重1.40的H2SO4，加水到
刻度，摇匀，立即用折叠滤纸过滤，此滤液可重复过滤，直至滤清。 取滤液50.00ml，测氮，其含氮值记为Y。 （四）计算：
高分子含氮量＝W－X； 低分子含氮量＝Y； 中分子含氮量＝X－Y。
三、蛋白酶活性的测定 （一）蛋白酶活力单位
在40℃、pH3.0条件下，1min水解酪素产生相当于1ug酪氨酸所需的酶量，规定为一个酶活力单位（u）。 （二）试剂和溶液
1、乳酸缓冲液（pH3.0）
甲液：称取乳酸（80%—90%）10.6g，加水溶解并定容到1000mL。 乙液：称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容到1000mL.
使用溶液：取甲液8mL，加乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/l乳酸缓冲溶液。
2、Fomlin试剂：于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g (Na2MoO4·2H2O)25g，水700mL，85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多佘的溴（冷却仍有绿色需要于加溴水，再煮沸除去过量的溴 ），冷却，加水，定容至1000mL，混匀，过滤制得的试剂应呈黄色，贮存于棕色瓶中内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3、0.4mol/L碳酸钠溶液(Na2CO3) ：称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL
4、0.4mol/L三氯乙酸(CCl3COOH)：称取65.4g三氯乙酸(CCl3COOH)，用水溶解，定容至1000mL。
5、10.00mg/mL酪素溶液：称取酪素1.000g，准确至0.001g，用2—3滴浓乳酸湿润后，加入pH3.0的乳酸缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用缓冲液（6.6.2.1）稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 6.7.2.6 L—酪氨酸标准溶液
a．准确称取预先于105℃干燥至恒重的L—酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸定容至60m溶解完后定容至l00mL即为1.000mg/ml酪氨酸标准溶液。
b．吸取100.0ug/mL酪按酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得100.0u/mLL—酷氨酸标准溶液。 （三）试验步骤
1、标准曲线的绘制
a．L—酪氨酸标准液按下表配制
表 酪氨酸标准溶液的浓取100.0ug/mL酪氨酸管号 加水体积，mL 度，ug/mL 标准液的体积，mL 0 0 0 10.00 1 10.00 1.00 9.00 2 20.00 2.00 8.00 3 30.00 3.00 7.00 4 40.00 4.00 6.00 5 50.00 5.00 5.00