反应生成的氮气，一半来自氨基酸，一半来自亚硝酸。测定氮气的体积可以
计算氨基酸的含量。
Ⅳ 与二硝基氟苯反应：Sanger反应
这个反应首先被英国的Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的N末端氨基酸 。
Ⅴ 与异硫氰酸苯酯反应：Edman反应
最早Edman用此反应测定蛋白质的氨基酸序列，也是氨基酸序列分析仪的工
作原理。
α-氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰
氨基酸（PTC－氨基酸）；在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物（PTH－氨基酸，无色物质，层析法分离鉴定）。
4、氨基酸的分离和分析方法
① 纸色谱法：分配层析的一种 分离鉴定氨基酸最简单有效的方法
滤纸纤维素吸附的水是固定相，展开剂是流动相。由于氨基酸在两相中溶解度的差异而在固定相和流动相之间不断分配，向上展开，以至于展开后分布在滤纸上的不同位置。 用茚三酮显色。
根据Rf值鉴定：在纸层析中，从原点至氨基酸停留点的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）之比，称为Rf值。Rf＝X/Y 双相层析 优点：简便
缺点：定量精密度低，误差大
② 薄层色谱：分配层析的一种，常用的氨基酸定性定量分析方法。 把吸附剂或支持剂（硅胶、氧化铝、硅藻土以及纤维素微晶粉等）涂布在玻璃板上成为一薄层。
优点：灵敏度高（比纸色谱法高10－100倍、分离快（一般为几分钟到几十分钟）、显色方便。
③ 离子交换色谱法：氨基酸大量制备和微量分析 以离子交换树脂为支持物的色谱法
离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯－苯二乙烯等不溶性高分子化合物。球形颗粒
阳离子交换树脂含有酸性基团（强酸型－SO3H、弱酸型－COOH），可解离出H＋，溶液中的阳离子可以和H＋发生交换结合在树脂上。
阴离子交换树脂含有碱性基团（强减型－N(CH3)OH、弱碱型－NH3OH） 分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂。
树脂转型：碱处理，从H型转化为Na型
上样：氨基酸混合物（pH2－3），这时氨基酸以阳离子形式存在，与钠离子交换而被吸附在柱子上。氨基酸与树脂间结合的程度主要取决于它们之间的静电吸引力，与氨基酸侧链和聚苯乙烯之间的疏水作用也有关。
洗脱：降低氨基酸与树脂的亲和力，逐步提高洗脱剂的pH和离子强度。
＊ 在pH 3左右，氨基酸与树脂的亲和力 碱性氨基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸
④ 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，简称HPLC）：一种快速、灵敏、高效的分离技术。 特点：使用的固相支持剂颗粒很细，因而表面积很大； 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。
作业：
指出在正丁醇∶醋酸∶水的系统中进行纸层析时，下列混合物中氨基酸的相对迁移率（假定水相的pH为4.5）：
① Ile，Lys； ② Phe，Ser； ③ Ala，Val，Leu； ④ Pro，Val； ⑤ Glu，Asp； ⑥ Tyr，Ala，Ser，His；
四、蛋白质的分子结构
1、一级结构：蛋白质中氨基酸的组成及其排列顺序。
一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水连接形成一种酰胺键，成为肽键。氨基酸以这种肽键连接起来的化合物称为肽。
多肽链中有羧基与氨基形成的肽键部分重复规则排列，构成肽键骨架，称为共价主链。肽链上的R代表各氨基酸的不同侧链上的基团，它们对于维持蛋白质的分子结构和行使功能都起着重要的作用。
氨基酸残基 肽键
氨基末端（N端） 羧基末端（C端）
肽键：① 肽键实际结构是一个共振杂化体
② 肽键中的四个原子和相邻的两个α-碳原子处于同一平面上，肽平面 ③ 在肽平面内，两个α-碳原子处于反式结构；含有脯氨酸的肽键可以
是反式的，也可以是顺式的；
④ C－N单键具有40％的双键性质，不能自由旋转，键长0.133nm（Cα
－N单键0.145nm、C＝N双键0.125nm）；C＝O双键具有40％单键性质，键长0.124nm（C－O单键0.141nm、C＝O双键0.121nm）； ⑤ 肽键的亚氨基－NH－在pH 0－14的范围内，没有明显的解离和质子
化的倾向。