第 1 页 共 10 页 ZL/SOP/TZ/00902 高效液相色谱法操作规程
文件名称 高效液相色谱法操作规程 文件编号 ZL/SOP/TZ/00902 制 订 审 核 批 准 人 颁发部门 质量部 执行部门 质量部 分发部门 质量部
一、目的：建立高效液相色谱法的操作规程，确保检验操作规范化。 二、适用范围：适用于本公司原辅料中高效液相色谱检查的标准操作。 三、责任者：QC检验员对本规程的实施负责。 四、规程 1、简述
制订日期 审核日期 批准日期 颁发日期 生效日期 共10页
年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 1.1引用标准：《中国药典》2015年版四部通则0512、《中国药品检验标准操作规范》2010年版。
1.2高效液相色谱法（HPLC）是一种现代液体色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相（具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液）泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。
1.3高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
1.4高效液相色谱仪基本由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。 2、对仪器的一般要求
2.1 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶(又称ODS)最为常用。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在15nm以下的填充剂适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填充剂。
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以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱使用温度，但不宜超过60℃。
2.2 检测器 最常用的检测器为紫外检测器。紫外检测器为选择性的检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。紫外检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系。采用紫外检测器时，所用流动相应至少符合《紫外-可见分光光度法操作规程》（ZL/SOP/TZ/01002）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。 2.3 流动相 可采用固定比例（等度洗脱）或按规定程序改变比例（梯度洗脱）的溶剂组成作为流动相系统。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。
各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相组成的比例、梯度洗脱程序中的时间长度、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于等于50%）相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限。如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限。 3、系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。
按各品种项下的要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。
3.1 色谱柱的理论板数（n） 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液，记录色谱图，通过色谱工作站处理，可直接读出色谱柱的理论板数。也可量出供试品主成分峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽W或半高峰宽（Wh/2），按n=16（tR/Wh）2或n=5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。
3.2 分离度（R） 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。通过色谱工作站处理，可直接读出色谱柱的分离度。
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计算公式：
R?2?(tR2?tR1)2?(tR2?tR1)或R?W1?W21.70?(W1,h/2?W2,h/2)式中：
tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1、W2及W1，h/2、W2，h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。
3.3 灵敏度 用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比（S/N）来表示。通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。
3.4 拖尾因子（T） 用于评价色谱峰的对称性。 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。 计算公式：
T?W0.05h2d1 式中：
W0.05h为5%峰高处的峰宽； d1为峰顶点至峰前沿之间的距离。
除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。峰面积法测定时，T值偏离过大，将影响峰面积的准确测量，进而影响定量的准确度。
3.5 重复性 用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加人规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0% 。 4、高效液相色谱仪的使用要求
4.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程(JJG705－90)”的规定进行定期检定，应符合规定。
4.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。