BCA测蛋白浓度

BCA蛋白浓度测定

一. 原理 BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成,实现了蛋白浓度测定的简单,高稳定性,高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25 微克/毫升,最小检测蛋白量达到0.5微克,待测样品体积为1~20微升。

二. 试剂盒组份 组 份 Cat: KGPBCA (250 assay酶标板/50assay 1mL比色杯) 蛋白标准溶液(0. 5 μg/μL ) 5 mL BCA试剂A 25 mL×2 BCA试剂B 1mL

三. 操作步骤 A. 酶标板操作

1. 标准曲线的绘制:取一块酶标板,按照下表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液(μL) 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水(μL) 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量(μg) 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

孔号 蛋白质溶液(μL) 去离子水(μL) 相应蛋白质含量(μg) 0 0 20 0 1 1 19 0.5 2 2 18 1 3 4 16 2 4 8 12 4 5 12 8 6 6 16 4 8 7 20 0 10 2. 根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀;

3. 各孔加入200μL BCA工作液;

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec,37℃放置30分钟,然后在562nm下比色测定。以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线;

5. 稀释待测样品至合适浓度,使样品稀释液总体积为20μL,加入BCA工作液200μL,充分混匀,37℃放置30分钟后,以标准曲线0号管做参比,在 562nm波长下比色,记录吸光值;

6. 根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(μg),除以样品稀释液总体积(20μL),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单 位:μg/μL)。

四. 注意事项

1. 配制好的混合BCA工作液室温24小时内稳定。

2. 加入BCA工作液后,也可以在室温放置2小时,或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升 高而加快。如果浓度较低,适合在较高温度孵育,或延长孵育时间。

3. 待测样品浓度在50~2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。

4. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响,需确保EDTA低于10mM,无EGTA,二硫苏糖醇低于1mM,β-巯基乙醇低于1mM.不适用BCA法时 建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。

5. 操作时要带手套。 五、储存

BCA 试剂A 和BCA 试剂B 室温保存,蛋白标准液-20℃冻存。

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