大豆PM18B、PM30耐盐功能和定位研究
大豆PM18B、PM30耐盐功能和定位研究
第二章大豆PM18B、PM30多克隆抗体的制备 一、实验材料
二、实验方法
1．PM18B-His和PM30-His的克隆 1.1 引物的设计
通过NCBI（网址www.ncbi.nlm.nih.gov）进入Genbank数据库，查找大豆PM18(AF009953.1)和PM30(AF117884.1)基因碱基序列，应用GeneTool软件，分别设计上下游引物，扩增开放阅读框(ORF)的cDNA序列。PM18B的上下游引物分别命名为PM18AF和PM18AR，分别带有酶切位点pagⅠ和EcoRⅠ；PM30的上下游引物分别命名为PM30AF和PM30AR，分别带有酶切位点NcoⅠ和EcoRⅠ。两个基因的上游引物都带有His标签。引物由上海生工生物工程有限责任公司合成。两个基因的引物的碱基序列如下： PM18AF:5’CCGTCATGAGGCATCATCATCATCATCACATGGCGTCAAGACAGCAAT3’ PM18AR : 5'CACGGAATTCTCACATTTTCTCCCTACGA 3'
PM30AF:5’CCGCCATGGGGCATCATCATCATCATCACATGGCATCCCATAGGCAAAG3’ PM30AR:5’CACGGAATTCTTAGTAATTTCTGCGGTTGT3’ 1.2 大豆胚根总RNA的提取
大豆白农6号种子用双蒸水在25℃的培养箱中培养24h，收取刚刚突破种皮的大豆胚根,利用Trizol 法提取其总RNA。方法如下：
（1）将大豆培根放入经液氮预冷的研钵中，迅速研磨成粉末。取50-100mg加入到1 ml Trizol中（粉末体积不要超过总体积的1/10），震荡混匀。 （2）室温（15-30°C）静置5 min。
（3）加入200μl氯仿，用手剧烈震荡15 -30s，彻底混匀，室温放置2-3 min。
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（4）4°C，12000g离心15 min，将水相转移到新EP管中。 （5）加入预冷异丙醇500μl，室温放置10-20 min。
（6）4°C，12000 rpm，离心10 min。弃上清，RNA沉淀于管底。 （7）RNA沉淀中加入1 ml 75%乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。
（8）4°C，12000 g离心5 min，弃上清。再快速离心，弃上清，重复两三次。室温放置晾干1-2 min。
（9）待酒精挥发，加入50 μl Rnase-free水溶解沉淀。
（10）核酸电泳及核酸仪分析所提取的RNA的质量并测其浓度。-80°C保存。 1.3 大豆胚根总cDNA的制备
操作参考宝生物工程（大连）有限公司的PrimeScriptRT-PCR Kit 说明书。操作如下： （1）在Microtube管中配制下列混合液。 dNTP Mixture（10 mM each）1μl Oligo dT Primer（2.5 μM）1μl Template RNA100 pg～1 μg RNase Free dH2O up to 10 μl
（2）在PCR仪上进行变性、退火反应：65℃，5 min；4℃，forever。 （3）离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。 （4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。 上述变性、退火后反应液10μl 5×PrimeScript Buffer 4μl RNase Inhibitor（40 U/μl）0.5μl PrimeScript RTase（for 2 Step）0.5μl RNase Free dH2O 5μl
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Total Volume 20μl
1.4 PM18B-His和PM30-His的扩增
以大豆种子 RNA 的反转录反应液为模板，利用PM18AF或PM30AF和PM18AR或PM30AR 引物进行 PCR 反应，扩增PM18-His和PM30-His，PCR 反应体系为：
5×PrimeSTARBuffer（Mg2+ plus） dNTP Mixture（各2.5 mM） PM18AF或PM30AF（10μM） PM18AR或PM30AR（10μM） 反转录反应液
10μl 4μl 1μl 1μl 10μl
PrimeSTAR? HS DNA Polymerase（2.5 U/μl） 0.5μl 灭菌蒸馏水
23.5μl
总体积 50μl
PM18B的PCR 反应程序为：PM30的PCR 反应程序为： 94℃5min 94℃5min 94℃30sec 94℃30sec 56℃30sec30cycles 56℃30sec30cycles
72℃ 45sec 72℃ 30sec 72℃10min 72℃10min
16℃forever 16℃ forever 1.5 PCR产物的回收
PCR产物全部进行琼脂糖凝胶（含 1％琼脂糖和 0.5ug/ml 溴化乙锭）电泳，凝胶成像系统照相。从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段的操作参考宝生物工程（大连）有限公司的