环境工程微生物学大实验实验报告
实验十二 环境中四环素抗性细菌的分离鉴定 组员：吴富华，张真，，金炯震 环5205 一、实验目的
1、自行设计实验方案从环境中分离四环素抗性菌的实验方法。 2、分离获得四环素抗行菌。
3、检测并分析获得的菌株的四环素抗性强弱。
4、学会通过16SrDNA鉴定实验获得的菌株的种属。 二、实验要求
1、自行设计实验证明富集培养是否成功。
2、观察并记录实验现象，作适当的分析或解释。 3、获得至少一株四环素抗性菌（不要多于三株），并进行短期保存。
4、根据实验视频指导和说明，完成菌株基因组DNA纯化，16SrDNA的PCR扩增。 5、比较各组筛选出的抗性菌抗性强弱。
6、各组间交流实验过程和实验结果，分析抗性菌抗性的影响因素。 7、养成良好的实验习惯和团队合作的作风，并给出评价。
三、实验器材
1、培养基（营养琼脂，琼脂粉，酵母膏，胰蛋白胨，氯化钠），提供四环素，琼脂糖，灭菌条件。
2、室温和37℃恒温培养箱和摇床。
3、离心机，漩涡震荡仪，PCR仪，电泳仪，紫外成像分析仪。
四、实验步骤（略）
1、配置富集培养基和四环素梯度培养基 2、四环素抗性菌富集培养 3、单菌株筛选
4、四环素抗性强弱比较
5、单菌株基因组DNA的提取 6、16SrDNA的PCR扩增 7、PCR产物电泳
实验内容、具体操作
四环素抗性菌的培养与筛选： 时间 4.24 实验内容 自行设计方案配制液体富集培养基（培养液A）； 用老师提供的琼脂营养粉配制培养液以备倒平板用。 灭菌，加入四环素，配制浓度梯度的富集培养液和固体培养基； 向富集培养液中加入活性污泥。 培养液于恒温箱中过夜培养； 备注 液体培养基（500ml蒸馏水，1.5g牛肉膏，5g蛋白胨，2.5g氯化钠，调PH至7左右）； 待灭菌 灭菌1.5h，培养液和固体培养基的四环素浓度梯度为（1024mg/L，512mg/L，256mg/L，128mg/L，64mg/L，32mg/L，16mg/L），做两组平行实验相互对照。注 4.25 固体培养基放入冰箱保存。 4.26 4.27 平板划线；恒温箱过夜培养。 观察菌株生长状况； 镜检； 配制斜面培养基； 挑选抗性最高的菌株进行斜面富集培养。 意：在倒平板前要趁热加入四环素并迅速混匀。 将14支试管培养液的菌液平板划线到相应四环素浓度的培养皿中。 平板划线结果发现出现菌株的四环素最高浓度为256mg/L； 配制四环素浓度为256mg/L的斜面培养基； 镜检三株菌株皆发现为阴性； 选了一株抗性最强的代表性菌株斜面富集，做两组平行实验。 将斜面培养所得的菌株移植冰箱冷冻保存。 将自己选出的抗性最强的菌株分别接种到助教提供的六个不同四环素浓度的培养皿（1024mg/L，512mg/L，256mg/L，128mg/L，64mg/L，32mg/L） 4.28 5.8 观察斜面培养的菌株生长状况 将所得菌株与老师提供的阴性菌和阳性菌进行镜检，发现为阳性； 四环素抗性强弱比较。 单菌株基因组DNA提取（5.17进行步骤1-4；5.18进行步骤5-10；5.20进行步骤11） （1）选择5.8号挑选的菌株进行DNA提取实验；
（2）取200μL菌液转移到1.5mL灭过菌的EP管中，10000rpm常温离心1min，去掉上清（得到菌细胞）。菌细胞可在-20℃冻存。
（3）如果是革兰氏阳性菌，取100μL，1mg/mL的溶菌酶/TE加到菌液中，漩涡震荡混匀，37℃温浴1h（溶菌步骤）。
（4）用取液器（移液枪）缓慢吸加500μL（革兰氏阳性）或600μL（革兰氏阴性）裂解缓冲液和20μL，20mg/mL蛋白酶K（proteinase K），充分混匀，50℃过夜（完全裂解细菌并降解所有蛋白质）。
（5）第二天，使用1mL一次注射器对溶液进行快速反复吹吸，一般操作十次以上（打断基因组DNA）。
（6）用取液器（移液枪）缓慢吸取600μL中性酚氯仿（pH6~8），振荡混匀，13000rpm离心5min（变性剩余蛋白质，并沉淀）。
（7）用取液器（移液枪）缓慢吸取400μL上层清液加入新管中，用取液器缓慢吸加异丙醇500μL，充分混匀，离心13000rpm，5min，弃上清（沉淀DNA）。 （8）用取液器（移液枪）缓慢吸加600μL，70%乙醇，颠倒混匀两次，离心13000rpm，0.5min，弃上清（先沉淀）。
（9）离心13000rpm，0.5min，用微量取液器吸走剩余上清（加速沉淀干燥）。 （10）开盖在室温下放置5~10分钟，使沉淀干燥。假如50μL无菌去离子水（干燥溶解DNA）。DNA可以保存在-20℃冰箱。
（11）使用NanoDrop仪器测定DNA浓度。
3、16SrDNA的PCR扩增（5.22完成）
（1）配置PCR反应母液：10×反应缓冲液5μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM上游引物 1μL，10μM下游引物 1μL，无菌去离子水 33.5μL，Taq酶 0.5μL（使用取液器，枪头触碰液面吸取）。混匀。
（2）取100~500ng基因组DNA，无菌去离子水稀释至5μL，加入反应母液并混匀。
（3）PCR扩增，反应程序如下设置：①95℃2min，②98℃10s，③55℃30s，④72℃1.5min，⑤回到②，35个循环，⑥52℃，5min，⑦4℃维持。
PCR产物电泳（5.22完成）
（1）0.8%琼脂糖凝胶的配制：在500mL锥形瓶中加入1×TAE工作液100mL（从50×TAE即50倍浓缩的TAE储液来稀释获得），加入0.8克琼脂糖，微波炉加热至沸腾，立即取出（注意防烫伤），混匀观察是否完全溶解。一般反复三次即可全部溶解。加入10μL Gel-Red，轻轻摇匀后倒入事先插好小孔梳子制胶版中。置于通风橱中凝固30分钟。
（2）取出PCR产物，每50μL体积加入6μL的10×上样缓冲液（10×loading buffer）,混匀。将制好的胶轻轻拔去梳子，放在电泳槽中，有空的一边朝向负极。加入1×TAE使得缓冲液正好没过凝胶，胶孔中无气泡。在每个胶孔中加10μL样品，最后在边上孔加10μLDNA分子量标准（DNA marker）和阳性对照（助教预实验获得）。设定电压为120V，等蓝色电泳带跑至一半胶长度后（一般20~30min），停止电泳。
（3）将电泳后的胶放在紫外成像仪上，拍照，确定目标DNA条带。
六、实验结果记录与讨论
1、抗性比较平板划线结果图：（结果展示顺序为四环素浓度从16mg/L~256mg/L，我组1024mg/L、512mg/L平板未长出菌落，方位为每个图片上部标有w5部分）
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