17周五6，7节，教三-106 食品安全检验技术
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第一章样品的前处理技术
1. 超临界流体萃取的定义：用超临界流体作为溶剂，用来有选择性地溶解液体或固体混合物中溶质的分离技术称为超临界流体萃取。
2. 超临界流体的性质：（1）超临界流体的传递性质
超临界流体的密度与液体接近；粘度与普通气体接近；自扩散系数也远远大于一般液体。因此，与一般溶剂相比，在超临界流体中，可更快进行传质，短时间内达到平衡，从而高效地进行分离。甚至可以简化固体粉末的预处理。 （2）超临界流体的溶解性能
超临界流体的密度接近液体超临界流体的密度接近液体，超临界流体对液体、固体的溶解度也与液体接近。超临界流体溶解能力与压力、温度及是否加入提携剂有关。
3. 提携剂的作用
提携剂也称共溶剂、修饰剂、改进剂,是一种加入超临界流体系统中的少量溶剂,它的加入能明显改变超临界流体系统的相行为,可增加溶解度；可降低操作压力或减少流体的用量
P11T1T2342P2P11T2T2342P2P1P21T12T23T15(a)等温法4(c)吸附法(b)等压法T1=T2P1＞P2T1＜T2P1=P2共溶剂的作用:①提高溶解度;②增加萃取1—萃取槽2—膨胀阀1—萃取槽2—加热器过程的分离因素；③提高溶解度对温度或压力的3—分离槽4—压缩机3—分离槽5—冷却器敏感性。其作用机理可能是分子间的范德华力或形成氢键。
T1=T2P1=P21—萃取槽2—吸收剂3—分离槽4—泵4. 超临界萃取典型流程：超临界流体萃取过程基本上由萃取阶段和分离阶段组成，右上图就是三种典型的流程。
5. 固相萃取的原理
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称 SPE)，也称固相提取，是一项结合了选择性保留、选择性洗脱等过程的分离技术。当复杂的样品溶液通过吸附剂时，吸附剂会通过作用力选择性地保留目标化合物或者干扰物，其他组分则透过吸附剂流出小柱，然后用另一种洗脱能力较强的溶剂体系选择性地把目标物洗脱下来，从而实现对复杂样品的分离、纯化和富集。
6. 固相萃取的作用：
净化：去除干扰物，优化色谱图，增加定量准确性 富集：浓缩样品增加灵敏度 转换溶剂：适合色谱分析 保护色谱柱不受污染,延长使用寿命
7. 固相萃取的操作程序：（活化、上样、洗涤、洗脱）
（1）活化吸附剂：萃取之前要用适当的溶剂淋洗小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。 （2）上样（吸附）：倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂。 （3）洗涤（去除杂质）：在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉 （4）洗脱（洗脱并收集目标物质）
3、固相微萃取的原理（数学表达式），SPME 的特点（集取样、萃取、富集、进样于一身）；提高固相微萃取萃取效率的方法
8. 固相微萃取的原理（数学表达式）
对于一个单组分的单相体系,当被分析有机物在萃取头与萃取体系之间达到平衡时,分析物与萃取头之间有一分配系数K,该分配系数与分
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析物在萃取体系中的量有如下关系:（右图所示） 式中:N 为吸附于萃取头上分析物的量; C0 为萃取前分析物在样品中的浓度;
K为分析物在萃取头和样品间的分配系数; Cs 为分析物在萃取后样品中的浓度; Cf 为分析物在萃取头中的浓度; Vf 为萃取头的体积;
Vs 为样品的体积。 可以看出,体系中的K及Vf 值是影响方法灵敏度的重要因素。
9. SPME 的特点
（1） （2） （3） （4）
SPME 的特点是集取样、萃取、富集、进样于一身。
SPME易于操作,是试样与固相涂层直接作用,几乎不消耗溶剂,降低了成本,保护了环境。SPME 的速度取SPME是一种基于气固吸附(吸收) 和液固吸附(吸收) 平衡的富集方法,利用分析物对活性固体表面(熔SPME技术是根据有机物与溶剂之间的“相似者相溶”的原则,利用石英纤维表面的色谱固定相或吸附剂
决于分析物分配平衡所需的时间,一般在2～30 min 内即可达到平衡。该技术适用于微量或痕量组分的富集。 融石英纤维表面的涂层) 有一定的吸附(吸收) 亲合力而达到被分离富集的目的。
对分析组分的吸附作用,将组分从试样基质中萃取出来,并逐渐富集,完成此试样前处理过程1在进样过程中,利用气相色谱进样口的高温将吸附的组分从固定相中解吸下来,由色谱仪进行分析。
10. 提高固相微萃取萃取效率的方法
萃取过程中不可避免地出现由于萃取涂层体积远远小于样品体积而在竞争吸附中造成萃取灵敏度低的问题。针对这种情况，可以采用下列几种方法解决：
（1）加热样品提高待测物质的挥发度，加快传质速率。这时需要注意的一个问题是,由于温度的升高，会使待测物在顶空与涂层间的分配系数下降，导致涂层吸附能力降低。所以，在实际操作中应选择一个最佳萃取温度或在加热样品的同时将萃取纤维用干冰冷却保护起来。减少顶空体积和不断搅拌样品也有利于提高萃取效率。对于土壤样品，在加热的同时还可以加入少量水或表面活性剂来作调节剂，以提高萃取效果。例如，在高温下涂层吸附含水10％的土壤样品中的待测物要显著高于不含水的样品。
（2）增加涂层的厚度是提高吸附量、降低检测限的另一途径。而且不同涂层厚度适用的对象也不同。通常，涂层薄的石英纤维适合于萃取分子量大的化合物，而涂层厚的则适宜于易挥发和分子量小的化合物。
（3）衍生化：对于强极性待测物还发展了现场衍生化的方法，通过衍生反应来降低待测物的极性，使得易于分析。目前普遍使用的有两种衍生化方法
①先将衍生试剂加入待测样品中进行衍生化反应后再进行SPME处理；
②先将萃取纤维浸入衍生试剂中，待涂层中吸附了一定量的衍生试剂后进行SPME处理，这时在纤维涂层上萃取过程和衍生化反应同时进行。
为了提高高分子涂层对有机物的萃取能力，可以通过在水样中加入盐类（NaCl、Na2SO4）调节样品离子强度达到这一目的。由于非离子涂层只能有效萃取中性物质，所以，某些时候为了防止待测物质的离子化，还需要调节溶液的pH值。在实际操作中，应根据所处理样品的不同而灵活选用各种方法。
11.微波加热的原理
微波被加热的介质是由许多一端带正电、另一端带负电的分子(称为偶极子)所组成。 (1)偶极子的摆动。电场迅速交替，偶极子的取向也随之改变，偶极子作迅速的摆动。
(2)摩擦生热。由于分子的热运动和相邻分子间的相互作用，使偶极子的摆动受到阻碍，产生摩擦并产热。
(3)产生呈瞬间集中的热量。超高频交替变换的电场（微波频率为915MHz和2450MHz，1s内有9.15×108次或2.45×109次的电场变化）引起分子频繁的摆动，其摩擦产生呈瞬间集中的热量，从而能迅速提高介质的温度。
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12.微波萃取与传统加热方式的差异
传统的热萃取是以热传导、热辐射等方式由外向里进行；而微波萃取是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热。
13.微波萃取的机理及影响因素 机理：（1） 一方面微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质，到达物料的内部维管束和腺胞系统。由于吸收微波能，腺胞内温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，细胞破裂。细胞内有效成分自由流出，在较低的温度条件下萃取介质捕获并溶解。通过进一步的过滤和分离，便获得萃取物料。
（2）另一方面，微波所产生的电磁场加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率，用水作溶剂时，在微波场下，水分子高速转动成为激发态，加速其热运动，缩短萃取组分的分子由物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间，从而使萃取速率提高数倍，同时还降低了萃取温度，最大限度保证萃取的质量。 （3）当微波能作用于分子上时，促进了分子的转动运动，分子若此时具有一定的极性，便在微波电磁场作用下产生瞬间极化，并以24.5亿次/秒的速度做极性变换运动，从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互碰撞，以促进分子活性部分（极性部分）更好地接触和反应，同时迅速生成大量的热能，促进细胞破裂，使细胞液流出来并扩散到溶剂中。 微波萃取的影响因素 （1）溶剂的影响 （2）萃取时间的影响 （3）萃取温度的影响
（4）式样中水分或湿度的影响 （5）基体物质的影响
第二章生物检测技术
1. PCR的过程（变性、退火、延伸）： (1)DNA模板的解链（变性） 90℃~95℃，30s
理论上，在90 ℃左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存。
(2) DNA 单链与引物的退火（复性） 55 ℃~65 ℃ , 30~45s
引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率>>DNA自身复性几率 ）。
(3) 引物的延伸（新链DNA的合成） 70℃~75 ℃，30~60s （<2kb)
①首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成引物是特定的， 3’端没有固定的终止点，长短不一。
②第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点。
③N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域。 引物本身也是新生DNA链的一部分。 2. PCR的反应条件：
（1）预变性：94℃ 300s（高温起动:充分变性，防止非特异性扩增） （2）变性：90℃-95℃，30s -60s （3）退火：55-65℃ 30s-45s （4） 延伸：70-72℃ 30-60s （<2kb)
25-35次cycle后，延长延伸（72℃ ，10min；充分延伸), 冷却至4℃ 或加入EDTA至10mmol/L以终止反应。 3. PCR的反应试剂：
（1）模板：单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA
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模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度：0.2-1 ?mol/L。浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)：0.5-2.5 U/50 ?l。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP：dNTP浓度取决于扩增片段的长度，四种dNTP浓度应相等。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+：Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（6）标准的缓冲液：10X buffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或DDT） （7）无菌双蒸水或三蒸水
（8） 石蜡油或矿物油:30~50ul（封闭、防止高温时液体的挥发）
4、ELISA 基本原理；ELISA测定方法的操作步骤及关键点 ELISA 基本原理
酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体；
③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体起反应；
④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例；
⑤加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。 ELISA测定方法的操作步骤及关键点
（1）加样：在ELISA中除了包被外，一般需进行4~5次加样。
（2）保温：ELISA中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。
（3）洗涤：洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
（4）比色：ELISA板的实验结果可用肉眼观察，也可用酶标仪测定。肉眼观察也有一定准确性。
（5）结果判定：①用“+”或“-”表示。超过规定吸收值的标本均属阳性，此规定的吸收值是根据事先测定大量阴性标本取得的，是阴性标本的均值加两个标准差。
②直接以吸收值表示。吸收值越大，阳性反应越强，此数值是固定实验条件下得到的结果，而且每次都伴有参考标本。
③以终点滴度表示。将标本稀释，最高稀释度仍出现阳性反应，为该标本的滴度。
④以P/N表示。求出该标本的吸收值与一组阴性标本吸收值的比值，大于1.5倍、2倍或3倍，即判为阳性。
第三章食品中残留危害物质检测技术
1、有机氯农药残留量的测定
气相色谱法(GB／T 5009．19—2008)——原理、提取、净化的操作步骤、检测、计算；
(1)原理：样品中六六六、滴滴涕经提取、净化后用气相色谱法测定，与标准比较定量。电子捕获检测器对于负电极强的化合物具有较高的灵敏度(检出限达10-14g/ml)，利用这一特点，可分别测出微量的六六六和滴滴涕。不同异构体和代谢物可同时分别测定。
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