土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及
淀粉酶活力的测定
一、试剂材料和器材
1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤
2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、直尺、记号笔等。 离心机、721分光光度计
3、淀粉培养基，牛肉膏蛋白胨培养基 二、实验步骤 （一）采集土样
分别从生科楼楼下获取土样。用无菌铲子挑起离地表10cm~15cm的土壤约5g，装入无菌培养基。 （二）制备土壤稀释液
从培养基取1g土壤放入大锥形瓶中，加无菌水99ml，几颗玻璃珠，充分震荡约10分钟，使土样和水充分混合，使细胞分散。取1ml上清液至干净无菌试管中，并加入9ml无菌水制成10-3土壤稀释悬液。同理制成10-4土壤稀释悬液、10-5土壤稀释悬液，10-6并分别标号①、②、③
（三）制作平板
每种稀释度悬液取3副无菌培养皿, 在各培养皿底部贴上标签①、②、
③。取已熔化的淀粉培养基，倒入无菌培养皿中，冷却，制成平板（无菌操作）。 （四）涂布平板
用移液管从土壤稀释液①、②、③中各吸取0.2ml，对号放入已标记的淀粉培养基培养皿上，用灼烧冷却后的无菌的三角玻璃刮涂匀。每个浓度做个平板，并置于37℃培养箱中培养24h。24h后，取出不同稀释度的平板，将平板上的菌落接种到液体培养基中。取0.02mol/l碘液滴加在淀粉平板中菌落周围，观察形成透明圈的结果，并将形成透明圈的菌挑选出来。 （五）划线接种[1]
在无菌工作台中将接种环在火焰上烧片刻，挑取分离步骤中长出的菌落，划足够长的折线，然后，将接种再在火焰上烧片刻，再次划线，开头一横与之前的线轨迹接触，而后面的折线轨迹则不再与之前所划接触。最后，再在火焰上将接种针烧片刻，再次划线，这时的第一横与第二次划的线末接触，而后面的折线则需在空白的地方划。划线完毕之后就把培养皿放在37 ℃下培养24h，让其长出菌落。重复划线直到分离到纯的单菌落。此时挑取的菌落应是上次划线最终末端的菌落。
（六）镜检（单染色+芽孢染色）
挑取单菌进行芽孢染色，如果看到被染成绿色的芽孢且菌的大小形态一致，即为纯的芽孢杆菌。 （七）斜面培养基
每种菌接三支，两支保存，一支做各项生理生化鉴定。斜面接种，在并排5支试管上面平置截好的胶合板，再在胶合板上面并排放5支试管，然后将试管的上、下端分别用牛皮纸包好，用线扎紧，使胶合板两侧的试管保持平行，置高压锅中灭菌。需在37℃恒温箱里培养24h，之后在4℃冰箱中冷藏。斜面接种后，在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条，厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。 （八）菌落形态学鉴定
菌种及其菌落形态特征观察：将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态 、高度 、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。然后进行一系列的镜检——单染色、革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合附表中芽孢杆菌的指标。 （九）等离子诱变[2]
（1）制作菌悬液：将培养至对数期的菌液离心收集，生理盐水洗涤两次，用生理盐水稀释至OD600为0.6~0.8或菌浓度为10-8~10-6。 （2）等离子诱变仪的使用:
1.取金属载片在火焰外焰灼烧30s，待冷取放入已消毒的玻璃平板，取10ul的菌液涂抹在载片上。
2.将载有样品载片的平板移置等离子诱变仪的操作仓，用无菌镊子将镊子放到对应孔位，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口2mm处，并关闭仓门。