景；但是切记，有的抗体对盐浓度敏感，包括构象和溶解度，因此需要尝试。
如果以上策略仍然无法解决高背景，可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料（新的）放在一起孵育个把小时再用。如果还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。
这三种封闭蛋白的差异：
milk和gelatin封闭效果不错且价格便宜，但milk容易发霉变质，且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合（拮抗与抗原结合尤其突出；更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL！？）；BSA封闭效果不佳，且价格较昂贵。个人推荐gelatin，gelatin主要成分是骨胶原，蛋白很大，但可以通过加热打断成小蛋白，从而实现封闭各种分子量大小的蛋白。通常，我会将gelatin加到TBST中后直接灭菌，灭菌过程中，不溶的gelatin会逐渐溶解；由于gelatin可以灭菌（milk不可以），所以同样条件下，gelatin的存放时间明显长于milk。实际上，抗体可以反复用很久（通常一般的抗体常规稀释比，可以连续用一个月以上；对于老手用过2、3次的旧抗体更prefer，因此背景降到很低而效价正是最高的时候），通常抗体最后失效的原因不是因为使用次数过多，而是染菌；比较旧的抗体都会有很多的沉淀在底部，更长时间还会有异味。稀释的一抗靠添加NaN3并于4度保存延长使用时间；二抗不能加NaN3，但放在-20度反复冻融延长使用寿命（抗体并非绝对不可以冻融；只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响）。
抗体稀释液（一抗、二抗稀释液也可同也可不同）和封闭液可以相同，可以不同，因为抗体稀释液可以采用复方的，所以即使混合了少许，不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时，gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。
由于以上诸多可变因素，实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液（只能是多数通用），因此对待具体问题时，请具体对待（多花点心思摸索吧）。
原装抗体的保存：
1. 分装。每次一管，但是可能太多占地方，而且还会有粘壁的损失，不是很推荐。 2. 1：1加甘油，冻于-20度，可长期保存，此方法实际上也被很多国内的试剂公司广泛采用，诸如博士得，中杉，它们小包装的进口抗体通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查 ）。值得注意的是：不是所有的抗体都可以1：1添加甘油，要以抗体说明书为准，如果说明书中本身存在甘油，或特殊注明外，通常可以采用。
显影——淬灭的祸因
当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。
首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：
交联在二抗上的HRP酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL中主要包含两种成分，催化剂和中间递质（白色瓶子主要是过氧化物如双氧水）。催化剂的作用不用废话了，其中间递质主要是吸收化学能并将其传递到luminol之类的化合物上产生电子跃迁从而激发荧光。因此催化剂的效率和中间递质的传递效率直接影响荧光的强弱。本人曾自制过ECL并尝试改良，其间发现很多化合物、金属离子如Fe、Cu等能催化并高效传递能量，且不依赖于HRP
浓度，荧光信号能瞬间曝强；这其实与下文提到的一些粹灭原因有联系。
当初我自制的ECL最大的毛病在于稳定性不好，同理，商品化的ECL同样也有保质期的问题，往往最先失效的组分就是过氧化物，尽管他们必然添加过抗还原剂。其实，检验ECL是否失效的方法很简单，取稀释的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中观察荧光强度，即可知道ECL是否失效。
商品化的ECL价格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：将ECL滴加在保鲜膜上或干净的支持物上，如废弃的旧底片、塑料盒，有机玻璃盒等等（注意，国产的保鲜膜很多质量不过关，有两种潜在的问题，下面详述），然后倒扣膜于保鲜膜上，夹住一个角来回拖动数次至ECL均匀（有的产品说明书要求孵育1min）。另外平铺一张干净的保鲜膜，将膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后显影。mini3型胶整张膜孵育，ECL总体积0.7-1ml足矣。
哪些因素会影响荧光信号的强弱呢？（这部分实际上与导致荧光淬灭的因素部分重合） 1.保鲜膜的质量。a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL反应不充分，另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒（也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶，荧光转瞬即逝。
b. 保鲜膜的化工原料或拉制过程中，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。
目前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。 如果买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别注意这些支持物表面的干净，最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST盐结晶颗粒。
2.ECL孵育结束后膜需要控干。中学物理学过水会吸收光谱，因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请注意不能让膜完全干掉。某些信号较弱的ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；较好的试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。因此，按照我的方法，让自由流下的多余的ECL被吸走就好。
3.控干的膜要仔细用保鲜膜包被，防止接触外界异物造成荧光淬灭；同时，包裹保鲜膜时要细心，尽量不让正面保鲜膜和膜之间出现皱褶。皱褶的地方会堆积多余的ECL，要么形成一条荧光的亮线；要么由于液体吸收荧光或者局部区域HRP过度消耗，呈线条状淬灭。
4.在膜放入压片夹之前，最好肉眼观察一下荧光信号的强弱，这有利于判断实验可能出现的问题。很多人提问看见很强的荧光了，但怎么压片都没有信号，那么就是快速淬灭（闪灭，再怎么快速操作也拿不到这种情况下的荧光信号）造成的；有这个观察至少能够判断ECL孵育之前实验操作应该问题不大，而问题主要是淬灭。如果你省略这个步骤，那问题就非常复杂了，因为之前任何操作都可能导致白板，根本无法判断。
除上述的问题以外，还有哪些因素会导致荧光淬灭呢？
1. 抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。在电泳的章节就曾提过，如果上样量太大，不仅条带会粘连、弯曲，更可能导致淬灭。因为局部区域过多的HRP酶会快速消耗底物呈富氧态，条带出现烧灼样（取出膜会发现一条明显的暗黄色的带），荧光信号会闪灭或者条带空心（条带灰黑不实，则可能是显影液接近失效）。
2. 抗原浓度太低，荧光信号太弱，相对慢一点的淬灭。可能第一次压片能够获得很弱的条带，随后都不可见。
3. ECL试剂质量。除过氧化物因接触空气被逐渐还原外，ECL的成分通常都不稳定。如呈递电子跃迁能的中间递质其化学性质就不太稳定，因为它转换能量的特性决定其必是一个有中间态的化合物，长期接触空气会被逐渐氧化失效；luminol也有保质期。
4. 操作时间过长，膜逐渐彻底干掉。商品化的ECL会出现波形渐变，开始信号逐渐增强，背景一起升高；随后荧光完全衰减淬灭。
5.不良的实验习惯。坛子上曾经有人问及淬灭问题，提到显影夹子很脏。脏的显影夹主要有两种污染，铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，前者造成闪灭（催化作用），后者可能直接导致无荧光；只要有任何失误，诸如不小心刮破保鲜膜，保鲜膜包裹不严实（其实通常还真的不严实，因为你不可能包裹好几层）。于是，我问他用一个很脏的东西不觉得很别扭嘛，为什么不先抄起抹布擦干净再用呢。
6.淬灭的假象。少量沾在膜表面的二抗也会激发荧光，但ECL孵育时稍微晃动就消失了，可能产生淬灭的错觉。
Stirpping：
完整的WB流程结束后，可能需要重新标记某些膜，这时候就“可能”需要对膜stripping。这里用了“可能”二字，即不一定必须，那么首先讨论一下stripping的必要性。
Stripping排除其他的不讲，整个流程会耗费不少的时间，从节约时间的角度来讲能不做最好；并且stripping条件过于激烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜表面的抗原使WB的最终信号削弱；此外，stripping buffer未清除干净时，其中的某些组分一定会干扰第二种抗体的结合。那么在什么条件下不需要stripping呢？
1． 当A蛋白和B蛋白分子量差别5KDa以上（10KDa左右更保险），可将膜分割开（分别标记不同的抗体），这样就不需要stripping膜重新标记，且一次就能得到想要的结果。有人会将两种抗体混在一起标记整张膜，这样操作的前提是非常熟悉这两种抗体的杂带位置，且各自的杂带都不会干扰目的蛋白才可以如此操作；并且这样的抗体下次使用有了局限性，因此不太推荐。
2． 两种抗体种属来源不同时，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置非常靠近无法切膜，这时候也不一定需要stripping。轮番标记这两种不同的抗体时，只需要用TBST涮掉表面的ECL，时间可长（一时腾不出手来就扔在那边一直漂，中间可以换换液）可短（换液涮两三次），然后直接用第二种抗体标记同一张膜。不过，如果其中一种蛋白显影太强，隔天显第二种蛋白时可能会出现干扰（可能强可能弱）；但只要两个蛋白不是同样大小或者连在一起了，可以在最后作图时用PS切出来。
3． 当两种抗体种属来源相同时，有一种情况也不需stripping，诸如标记某蛋白的磷酸化和总蛋白时。由于磷酸化抗体通常识别能力较弱（相对于总蛋白而言），信号一般都不太强，此时也仅需简单的漂洗；但标记的顺序一定是先标磷酸化后标总蛋白。
以上避免stripping主要从节约时间的因素考虑，实际上当上述2、3点存在时，个人还是会用stripping buffer简单漂一下，然后用TBST换液漂洗3次再上第二种抗体；但如果时间较紧，就会真的省略。
Stripping膜至少有三种方法：
A．用TBST一直洗膜，洗8hrs以上就可以清除多数蛋白的信号，信号过强的蛋白如内参除外。所以，当你的抗体非常弱的时候，孵育过夜实际上相当于stripping，新的信号不会出现，原来的信号也会被漂洗干净，出现白板。
B．请参考millipore PVDF膜附送的说明书配方（没有，请Google），上面提到如果信号很强，可以在50度反应。需要提醒的是，由于巯基乙醇亦挥发，可以考虑临时添加。
C．如果做过IP，你就知道可以用低pH的Glycine-HCl洗脱beads上特异性吸附的蛋白。
同理，0.1M Glycine（pH2.5,30min）也可以用于stripping膜，这是已知最廉价的高效洗膜方案。而且经过TBST （10min*3）漂洗后，膜上的pH早就恢复到正常值，此时不存在上述stripping buffer残留成分干扰第二种抗体标记的情况。如果第一种蛋白信号过强，同样可以在50度stripping提高洗膜强度。
此外，膜风干后，表面结合的二抗也会脱落，不过不是很推荐。
看完stripping这个部分，再多想一层，你一定会找到同一张膜多次标记不同抗体的窍门。
如果有A、B、C三种蛋白，因分子量过于接近无法切膜： a.如果A、B的抗体同是兔抗，C的抗体为鼠抗，则最合理的标记顺序为A-C-B或者B-C-A。 b.A、B、C的抗体同种来源，A、B几乎在一起，条带粘连；C靠下。如果A、B重要性差不多、B信号稍弱，则B-C-A；如果A的结果是最关键的，尽管B信号弱，一般还是A-C-B。因为，经过两次stripping buffer洗脱，且两轮WB流程的时长都超过8hrs（一抗习惯4度过夜孵育），实际上在标记第三种抗体时，相对于经历了3次不同强度的stripping；不要担心第一种抗体还会有很强的干扰。
当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。
首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：
交联在二抗上的HRP酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL中主要包含两种成分，催化剂和中间递质（白色瓶子主要是过氧化物如双氧水）。催化剂的作用不用废话了，其中间递质主要是吸收化学能并将其传递到luminol之类的化合物上产生电子跃迁从而激发荧光。因此催化剂的效率和中间递质的传递效率直接影响荧光的强弱。本人曾自制过ECL并尝试改良，其间发现很多化合物、金属离子如Fe、Cu等能催化并高效传递能量，且不依赖于HRP浓度，荧光信号能瞬间曝强；这其实与下文提到的一些粹灭原因有联系。
当初我自制的ECL最大的毛病在于稳定性不好，同理，商品化的ECL同样也有保质期的问题，往往最先失效的组分就是过氧化物，尽管他们必然添加过抗还原剂。其实，检验ECL是否失效的方法很简单，取稀释的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中观察荧光强度，即可知道ECL是否失效。
商品化的ECL价格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：将ECL滴加在保鲜膜上或干净的支持物上，如废弃的旧底片、塑料盒，有机玻璃盒等等（注意，国产的保鲜膜很多质量不过关，有两种潜在的问题，下面详述），然后倒扣膜于保鲜膜上，夹住一个角来回拖动数次至ECL均匀（有的产品说明书要求孵育1min）。另外平铺一张干净的保鲜膜，将膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后显影。mini3型胶整张膜孵育，ECL总体积0.7-1ml足矣。
如何正确使用Quantiy One定量：（以下文字系摘录+改写整合）
WB做完，有时候我们需要对结果进行定量。目前最备受推崇的应该非Biorad公司的Quantiy One软件莫属，然而其$6K左右的售价令很多人望而却步；不过，这款软件之所以敢如此漫天要价，其最大的优点莫过于自动识别条带代替人工分析以降低主观误差，同时它
的很多功能渗透了艰深的数理理论以及概率统计的原理，这在其它各类免费的随机附送的蛋白定量软件上是乏善可陈的。不过，令人扼腕的是，又有多少人真的只是把它当做一款普通的“免费”软件在使用着——暴殄天物。
目前多数免费软件主要采用的是等高线定量法（Volumn Contour），Quantiy One也包含这部分内容且在网络教程里面流传最广，以至于很多人只会这种并不准确的蛋白定量方法。等高线定量法通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。这种分析方法有明显的弊病：人为圈定背景值且假定不同泳道的背景亮度一致；等高线的绘制处于“半自动”状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边缘；最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时候几乎无法绘制单一条带的轮廓（常出现连续的几个条带等高线相连而无法分离出单独条带的轮廓）。
实际上，最科学、严谨的蛋白定量方法应该是泳道/条带轨迹定量法（Trace Tracking）。这种方法使用起来步骤较为繁琐，必须通过泳道识别---电泳条带识别这两个连续的步骤才能进行定量。但它最大优点在于可以完全抛弃人为主观因素进行全自动定量。他的定量方式为：首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据。其次，它能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比；这个背景排除功能是等高线法无法做到的。最终，采用泳道/条带轨迹定量法分析条带光密度后，再结合Gauss Model Bands对电泳条带进行数理统计。
执行步骤：
由于Quantiy One只能识别黑白的TIF文件，而实际上发表论文时，很多杂志也要求提供TIF等格式的图片而非JEPG格式的；因此，考虑到这两层因素，我建议大家从一开始扫描就统一存贮为TIF格式的图片。
1.创建泳道：
a.打开我们要分析的电泳图片（以蛋白质电泳为例）。 b.选择“Lane-Auto Frame lanes”。这时如果您的电泳图片比较标准的话，Quantity One就会自动识别出每条电泳泳道的位置，而且将各个泳道的路径用一条红线标画出来；
如果您对软件自动标记的泳道不甚满意，您可以通过“Lane-Edit Frame”下级各个子菜单提供的功能对泳道框架位置、大小等进行调节；调节方法就是通过鼠标的拖放来实现。
如果您只需要分析其中几个泳道的数据而不想其他泳道的标记干扰您的视线，您可以通过“Lane-Single Lane-Remove Lane”删除您不需要的泳道的标记。
注意：
不是所有的电泳图片的泳道都能够被Quantity One自动识别。在不能自动识别的情况下，Quantity One就会弹出对话框告诉您它不能识别泳道。这时大家就需要手工绘制电泳泳道。方法和上面一样，同过“Lane-Single Lane-Creat Lane”来实现。只要用鼠标在您的电泳图片上顺着待标记的泳道的中轴线拖放就可以绘制出该泳道的标记红线。
2.不同泳道的背景排除：
我们要将我们的电泳图片进行前面谈到的泳道识别，不管是自动方式还是手工识别。然后选择“Lane-Lane Backgroud...”命令。选择该命令后，鼠标即变成一个绿色的“+”，将鼠标移到您打算进行背景排除的泳道，点击左键一下，立刻就会弹出如下图所示的对话框。
其中“Optical Density”显示得是该泳道光密度值的分布情况。大家会注意到这个分布曲线并不是紧贴着纵轴，而是位于纵轴上方分布。造成这个“悬空现象”的原因就是该泳道