江苏省淮州中学高三生物教学案（生物技术实践部分） 主备人：倪红梅
教学课题： 血红蛋白的提取和分离 课 型：复 习
考试要求：1.简述蛋白质提取和分离基本的原理。（A级） 2.尝试蛋白质的提取和电泳分离。（A级） 教学重点：凝胶色谱法的原理和方法。
教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 ★基础知识梳理与例题解析 一、蛋白质的分离方法 1、蛋白质分离的依据：
蛋白质各种特性的差异，如分子的 、所带电荷的 、 和 等。 2、分离方法： （1）凝胶色谱法 ①概念：也称 法，是根据 分离蛋白质的有效方法。 ②所用材料：凝胶是一些微小多空球体，大多数是由 构成的，如
或 。
③分离的基本原理：当蛋白质通过凝胶时，相对分子量不同，其通过的速度也不同。 相对分子量较 的蛋白质容易进入凝胶的内部，路程 ，移动速度 ； 相对分子量较 的蛋白质无法进入凝胶的内部，路程 ，移动速度 。 在层析柱中先洗脱下来的是相对分子量较量 的蛋白质。 （2）、电泳法：
①概念： 的过程。
②原理：一些生物大分（如 、 等）子，在一定pH下，其 会带上
正电或负电，在电场作用上这些带电分子会向着 的电极移动。因各种分子 的差异以及分子本身 的不同，迁移速度不同，从而实现各分子的分离。③常用方法： 电泳和 电泳。在测定蛋白质分子量时，通常使用 电泳。
例题1凝胶色谱法分离蛋白质的依据是 （ ） A.对其他分子的亲和力 B.溶解度 C.所带电荷多少 D.相对分子质量的大小 例题2凝胶色谱法中所使用的凝胶化学本质大多是 （ ） A.糖类化合物 B.脂质 C.蛋白质 D.核酸
例题3利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来 （ ） A.相对分子质量大的 B.溶解度高的 C.相对分子质量小的 D.所带电荷多的 二、蛋白质的提取和分离过程
蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。 1、样品处理
（1）红细胞洗涤 ① 目的：
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② 方法：分离（ 离心） 吸去上层透明 下层暗
红色的 液体用 倍体积的 洗涤 搅拌、 离心（重复 次，直至 ）
（2）血红蛋白的释放
①目的： ②方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加 到 的体积，再加 体
积的甲苯，置于 上充分搅拌10min
(3)分离血红蛋白溶液
①方法: 速度： 时间：
②结果：
注意：红细胞的洗涤的注意事项
洗涤次数过少，无法除去 ；离心速度 和时间 会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的要求。 2、透析-----粗分离
①目的：除去样品中分子量 的杂质或用于更换 。 ②原理：透析袋能使 自由进出，而 保留在袋内。
例题4选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处 （ ） A．血红蛋白是有色蛋白 B．红细胞无细胞核 C．红细胞蛋白质含量高 D．红细胞DNA含量高 例题5下列有关血红蛋白透析过程叙述中，错误的是 （ ） A.透析袋一般是用硝酸纤维素制成的
B.透析袋能使大分子蛋白质析出，得到纯化的蛋白质液
C.透析袋需放入磷酸缓冲液中透析12 h D.透析的目的是去除样品中较小的杂质 3、凝胶色谱操作——样品的纯化
（1）凝胶色谱柱制作：制作成功与否的标志： （2）凝胶色谱柱的装填 ①填充材料：交联葡聚糖凝胶
②方法：固定：将色谱柱 固定在支架上 装填：将凝胶悬浮液 装填入色谱柱内 洗涤：用 充分洗涤平衡凝胶12h
(3)样品的加入和洗脱：调整缓冲液面：与 面平齐 滴加透析样品：用量为 mL
样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层 洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱
收集：待 的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 mL一试管，连续收集
4、SDS—聚丙烯酰胺电泳——纯度鉴定
（1）蛋白质纯度鉴定的目的： （2）蛋白质纯度鉴定的方法：使用最多的是 注意事项：色谱柱填料的处理
①干燥凝胶加速膨胀的方法： ；这样不但节约时间，而且可以除去 ，排除 。 ②凝胶色谱柱的装填：装填的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填时不得有气泡存在，因为 。
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江苏省淮州中学高三生物教学案（生物技术实践部分） 主备人：倪红梅 例题6凝胶色谱柱的装填是凝胶电泳非常关键的步骤，凝胶的装填要紧密和均匀的主要原因是（ ） A.使凝胶充分吸水 B.阻挡大分子蛋白质析出 C.防止气泡在色谱柱内形成无效的空隙 D.降低洗脱速度
例题5下列有关血液成分的描述中,正确的是 ( )
A.血液由血清和红细胞组成,其中红细胞最多 B.在红细胞的组成中,约90%的是血浆蛋白
C.血红蛋白由4个肽链组成,包括2个α-肽链和2个β-肽链 D.血红蛋白的每条肽链环绕一个亚铁血红素基团,只能携带氧气
例题6将洗涤好的红细胞倒入烧杯中后,为了促使红细胞破裂,释放出血红蛋白质,需加入的物质是（ ）
A.质量分数为0.9%的生理盐水 B.3.0g的柠檬酸钠 C.蒸馏水和40%体积的甲苯 D.20mol/L的磷酸缓冲液
例题8在凝胶色谱柱中加入样品和洗脱的步骤中，下列操作错误的是 （ ） A.加样前，打开色谱柱下端的出口，使柱内面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐， B.将透析后的样品回到色谱柱的顶端，加样后打开下端出口 关闭出口 C.等样品完全进入凝胶层后关闭下端出口
D.用吸管将缓冲液加入凝胶柱，打开下端出口，进行洗脱
例题9凝胶色谱柱的装填是凝胶电泳非常关键的步骤，凝胶的装填要紧密和均匀的主要原 A.使凝胶充分吸水 B.阻挡大分子蛋白质析出 因是（ ） C.防止气泡在色谱柱内形成无效的空隙 D.降低洗脱速度 ★反馈练习
⒈蛋白质的提取和分离一般分为四步，下面顺序正确的是 （ ） A.样品处理 纯化 粗分离 纯度鉴定 B.粗分离 样品处理 纯化 纯度鉴定 C.样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 D.纯化 粗分离 样品处理 纯度鉴定
⒉下列有关缓冲液的叙述中，不正确的是 （ ） A.缓冲液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变 B.缓冲液通常由1种酸性或1种碱性物质单独配制而成 C.人体血液中有调节pH的酸碱缓冲对
D.调节缓冲剂的使用比例就可以制得不同pH范围使用的缓冲液
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