昆虫杆状病毒表达系统研究进展
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昆虫杆状病毒表达系统研究进展
摘 要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个
基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点，因而得到了广泛的应用。随着重组杆状病毒构建技术的不断发展，昆虫杆状病毒表达载体系统的操作在逐渐简化，重组杆状病毒获得的效率也在不断提高。昆虫细胞培养技术的改进和转基因昆虫细胞系的发展，进一步推动了昆虫杆状病毒表达载体系统在商品化药物、治疗性抗体、生物农药研发和基因治疗中的应用。尽管仍存在着重组蛋白降解的问题，但随着分子生物学技术的发展，对杆状病毒载体的研究与改造也会更加深入，未来昆虫杆状病毒表达载体系统的应用将更为广泛。 关键词：杆状病毒；多角体启动子；转基因昆虫细胞系；疫苗；治疗性抗体。
前言
作为当今基因工程四大表达系统之一，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus ex． pression vector system，IC-BEVS)的应用变得越来越广泛。它不仅具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点，且能同时在一个载体上表达多种蛋白。由于昆虫细胞易于悬浮培养，细胞培养基的改进也使得悬浮培养的细胞活率不断提高，最终得以实现昆虫细胞的大规模培养，这使得其在商业领域如生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得了广泛的应用[1]。
1 杆状病毒的分类与分子生物学
杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的DNA病毒。基因组DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 kb之间。 杆状病毒基因组可在昆虫细胞核复制和转录，DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，因其具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。其中，目前用作外源基因表达载体的杆状病毒主要为核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)。核型多角体病 毒在整个病毒生活周期中以包涵体病毒(Occluded virus，OV)和细胞外芽生病毒(Budded virus，BV)两种形式存在，它们在病毒感染中扮演着不同的角色[2]。
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OV病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染；OV病毒外层包裹了一层相对分子质量为29000000的多角体蛋白，它能保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活，并能使病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其他部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
目前已知基因组全序列的核型多角体杆状病毒有苜蓿银纹夜蛾核型多角体
病毒(AcMNPV)、家蚕核多角体病毒(BmNPV)、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV)、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)¨J，其中以AcMNPV研究最为深入[3]。
AcMNPV的基因表达分为4个阶段：立早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白——多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包涵体病毒的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％～50％，是病毒复制的非必需成分，但对病毒粒子有一定的保护作用。另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制的非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，这可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因的启动子具有较强的启动能力，且均为病毒复制的非必需成分，因此这两个基因位点成为了杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
2昆虫杆状病毒表达载体系统
昆虫杆状病毒表达载体系统作为目前被广泛应用的体外基因表达系统，相对于以大肠杆菌为代表的原核表达系统和包括酵母和哺乳动物的真核表达系统具有独特的生物学特性，因此日益受到人们的重视。杆状病毒具有很好的安全性：外源基因插入多角体蛋白基因座位后将引起后者的缺失或失活，这样重组病毒就不会形成多角体蛋白，使得病毒粒子缺少天然的保护物，故重组病毒在自然环境下极易失活，不会造成对人类的危害和环境的污染[4]。
与哺乳动物细胞表达系统相比载体构建周期短：昆虫杆状病毒表达系统载体的构建主要是针对杆状病毒，而非昆虫细胞系本身，这就大大缩短了从基因克
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