“电针调节Noggin表达对VD大鼠学习记忆过程中海马神经发生的.

“电针调节Noggin表达对VD大鼠学习记忆过程中海马神经

发生的影响”申请书正文

1、项目研究意义

随着人类社会进入21世纪,人口老龄化更加明显,老年期痴呆成为一个严重的医学和社会问题,而受到世界各国的关注。在我国,血管性痴呆是老年期痴呆的主要类型之一,且其发病率有逐年上升的趋势。血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由脑血管因素导致脑组织损害引起的智能及认知功能障碍的临床综合征。研究显示[1],约25%的脑卒中患者伴有程度不等的智能障碍,严重者不仅影响患者的生存质量,而且增加了社会和家庭的经济负担。

海马是目前公认与学习、记忆等高级神经功能活动具有密切关系的重要脑区,而海马最受缺血低氧的损害造成神经结构和功能的异常改变,成为痴呆等疾病的主要病理基础。新近研究表明,新生及成年哺乳动物与人的海马区域存在着神经发生(神经干细胞,neural stem cell,NSC),为人们深入研究海马功能及防治缺血性神经疾病提供了新的研究途径。血管性痴呆是迄今为止唯一可以预防的痴呆类型,早期积极预防治疗具有可逆性。采用针灸促进海马内神经发生向神经元方向分化并在脑组织内整合,对海马神经可塑性进行调节,改善学习记忆功能,无疑对VD的基础与临床研究具有重大意义。

干细胞是当前生命科学的研究热点,《Science》将干细胞研究评为21世纪最重要的十项研究领域之首,为世人瞩目。正是因为干细胞的特殊科学意义及其在医学上的应用前景,世界各国对此都投入大量的人力、财力进行有关基础和应用的研究。随着我省经济的发展,人民生活水平的提高,老年人口不断增加,而老年期痴呆、脑血管病等重大疾病也因之而增多。从新的思路研究这些疾病的发病机理和探索有效治疗方法,势必为提高我省人口健康水平有积极的促进作用。本项目的研究也正是基于理念而申请的立项的。

2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系

2.1 研究目标

开展对实验性VD大鼠的发病机理研究,证实海马的神经发生障碍是血管性痴呆的病理基础。进行电针对拟VD大鼠的治疗观察,在肯定疗效的基础上,结合现代医学的研究理论与技术,深入探讨针灸治疗血管性痴呆的海马神经发生作用机制。 2.2 与申请者研究工作长期目标的关系

申请者长期从事针灸治疗缺血性脑血管疾病的临床与作用机制研究,特别是对针刺治疗缺血性脑血管病的临床与实验有较深入的研究。申请者设计并实施完成2003年度广东省自然科学基金“电针对局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞影响的研究”(No.31458,排名第二);参与完成国家自然科学基金“针刺对局灶性脑缺血后突触可塑性促进作用的研究”(No.30271644,排名第五)和国家中医药管理局科研基金“针刺调节神经营养因子对缺血后脑可塑性促进作用的研究”(No.02-03JP36,排名第五)等项目。这为开展本项目的研究在相关技术和实验经验等方面提供了有力的支持。在上述研究基础上,本项目拟通过电针调节神经诱导因子Noggin基因的表达以调控VD大鼠海马神经发生机制,探讨针灸治疗VD的作用机理,为探索新的临床治疗方法、提高疗效,提供具有指导价值的科学依据。

3、项目研究内容,研究方案和进度安排

3.1 研究内容

本项目从中西医结合基础的角度,研究针刺治疗VD的海马神经发生机制,从调节脑与神经发育密切相关的神经诱导因子Noggin基因的表达为切入点,观察VD及电针治疗时海马神经发生的变化规律,新生神经细胞的增殖、迁移与分化,结合相应神经行为学的改变应用透射电镜从体视学角度证实其功能性突触的重建,探讨Noggin等在治疗VD时对神经发生的影响作用。旨在阐明针灸治疗VD的神经生物学作用机制,为针灸治疗缺血性脑血管疾病提供科学依据。具体如下:

1)观察VD大鼠造模后Noggin基因的表达情况,海马神经细胞丢失及病理形态学变化情况及齿状回(DG)神经发生的规律,电针治疗后三者的变化情况:

a.造模后不同时相Noggin的表达情况及电针干预后的变化;

b.造模后不同时相海马神经细胞丢失的情况与VD大鼠神经行为学及齿状回LTP之间的关系;

c.造模后不同时相海马齿状回(DG)新生神经细胞的变化规律及电针干预对其影响; d.造模及电针干预不同时相上VD大鼠神经行为的变化及LTP的诱导情况。 2)在上述研究工作的基础上,分析电针治疗VD的可能的作用机制:

a.研究脑与神经发育的神经诱导因子Noggin与海马神经发生(增殖、迁移、分化及功能性突触的形成)的关系;

b.研究大鼠海马神经发生情况与VD神经行为学及CA3神经突触重建情况的内在关系; c.证实电针治疗VD大鼠的机制是否通过影响海马神经发生而发挥作用。 3.2 研究方案

⑴动物模型

健康雄性老龄SD大鼠(12~15个月),体重350~500g。经Y-迷宫训练筛选后选择学习记忆成绩合格大鼠,按照Ohta等方法(Ohta H, et al. Brain Res, 1994; 653(1):231-234)永久性结扎双侧颈总动脉制作2-VO慢性脑灌注不足的拟VD模型。根据研究要求进行动物随机分组。部分动物进行假手术,用于对照研究。

⑵治疗与干预方法

①电针干预:采用督脉腧穴百会、大椎,采用毫针(1寸,30#)针刺接通电针治疗仪(G6805型)给予疏密波刺激(刺激参数:电流强度≤1mA,频率:5~15Hz/s,时间:20min)。部分实验中采用躯干背部肌肉丰厚处非穴点进行对照,以观察穴位的相对特异性;在动物造模后,每日电针治疗1次,分别连续给予治疗3d、1w、2w、3w、4w及8w。

②阳性药物对照(对部分VD模型进行对照):改善脑循环药物:尼莫地平(12mg/kg,灌胃)。在动物造模后每日给药1次,分别连续给药3d、1w、2w、3w、4w及8w。

③Noggin反义mRNA侧脑室注射:以乌拉坦腹腔麻醉大鼠固定于脑立体定位仪上,根据Pellegrino图谱,于侧脑室(AP:1.0, L: 1.5, H: 3.0)埋置不锈钢导管(外径0.7 mm,内径0.4 mm),以牙托粉固定于颅骨上,术后3 d 开始实验。进行侧脑室内注射时,将清醒大鼠固定于敞式装置上,在埋植的导管内插入注射内管,其下端超出套管0.5mm,另一端经塑料管与微量进样器连接,取反义寡核苷酸20μg/d(上海生工合成),按组别不同时间每日一次连续注射,每次注射时间不少于2 min。实验结束后,注入2 %滂胺天蓝( Pontamine sky blue),核对给药部位。

⑶指标检测与关键技术说明

①神经行为学观察:

a.Y型电迷宫检查:用MG-2Y型电迷宫(刺激电压:50V,延迟2s)筛选成绩合格动物。 b.Morris水迷宫检查:实验包括:定位航行实验:观察记录逃避潜伏期和游泳路径(搜索策略)。空间探索实验:观察规定时间内大鼠在池中的游泳路径(搜索策略)。

②脑组织取材:根据检测内容的不同,分别采用断头处死取脑和经心灌注固定取脑,HE及Nissl染色采用石蜡包埋切片,组化染色及原位杂交采用冰冻切片。

③原位杂交观测Noggin 在大鼠脑内的表达与分布:参照文献(蔡文琴,等.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.四川科学技术出版社,1994.354-432)采用漂浮法进行Noggin mRNA 原位杂交组织化学染色(Noggin 基因的cRNA 核酸探针,购自华美生物制剂公司;地高辛标记试剂盒抗地高辛抗体、碱性磷酸酶显色剂NBT/ BCIP均购自Rhoe 公司)。步骤简述:胃蛋白酶K37℃孵育、地高辛标记的探针42℃反应,碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体孵育,用NBT/BCIP显色,脱水、裱片、DPX封片。

④RT-PCR半定量检测Noggin的表达:分别取各组大鼠5只。海马总RNA提取按文献方法(Sambrook J, et al. Molecular cloning, a laboratory manual[M]. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press USA,1989.343-362)进行。PCR上、下游引物,通过网站(www.genome.wi. mit.edu)提供的引物设计程序(Primer 3.0)设计。反应液经96.6℃3min 预变性后,94℃60s、55℃60s、72℃60s循环30 次,反应产物置2%琼脂糖凝胶电泳,摄片,扫描半定量分析。

⑤免疫组化等方法观察海马神经发生情况:

a.BrdU标记方法:在大鼠处死的前3天开始,进行BrdU腹腔注射50mg/kg,每12h一次,连续注射4次,在最后一次注射后24h处死,进行各项指标检测。

b.BrdU组化染色前切片中DNA解链和变性的预处理:50%formamide(甲酰胺)/2×SSC中,置于64℃孵育箱,30min,入2N HCl中,37℃孵育30min,其余漂洗过程略。

c.BrdU免疫组化染色方法观察海马细胞增殖情况:参照Okano等的方法(Okano HJ, et al. Dev Neurosci, 1996, 18: 199- 209)及BrdU(2351,Sigma公司)染色说明书方法加以改进,采用ABC法进行BrdU免疫组化漂浮染色。

d.免疫荧光双重标记及荧光显微镜观察海马神经干细胞的增殖迁移、分化及与Noggin受体共表达情况:用鸡尾酒法染色,首先切片与小鼠抗BrdU单克隆抗体孵育,继之用Cy3标记的羊抗鼠抗体处理;入兔抗GFAP(Sigma公司)或兔抗TuJl(Sigma公司)、兔抗Noggin受体抗体(Lab Vision公司)孵育,FITC标记的羊抗兔抗体孵育,甘油封片,荧光显微镜下观察计数、拍照成像。

⑥HE染色及Nissl染色观测海马病理形态及神经元丢失情况。

⑦透射电镜(突触体视学)观察海马CA3区神经突触结构变化及电针对其影响:按照Freddari方法(Freddari B, et al. Brain Res, 1993;628:193),计算突触的数量和突触连接带与测试线的交点数,定量分析突触的突触数密度;再以XY-生物图像分析仪对突触界面曲率、突触后致密物质等进行定量分析。

⑷机制探讨

①观察电针对VD大鼠海马神经发生的影响

a.在模型建立后及电针干预的不同时相分别给予BrdU在体标记增殖细胞,采用免疫组化染色法观测电针对海马神经发生的全过程影响。

b.用BrdU + PSA-NCAM(多聚唾液酸化神经细胞黏附因子)对增殖细胞进行免疫双重荧光标记,采用激光共聚焦扫描显微镜观察电针对增殖细胞的迁移和突触形成的影响。

c.用BrdU + GFAP(GFAP,胶质纤维酸性蛋白,胶质细胞标记物),BrdU + TuJ1(βⅢ-tubulin,早期未成熟神经元的标记物)或NeuN(神经细胞核抗原,成熟神经元标记物)对增殖细胞进行免疫荧光双重标记,采用荧光显微镜观察电针对增殖细胞分化的影响。

②通过侧脑室注射外源性Noggin mRNA反义寡核苷酸或Noggin因子受体抗体,观察神经发育诱导因子在电针治疗VD中对海马神经发生的影响。

③应用RT-PCR技术对造模后和电针治疗不同时相上海马内Noggin的表达进行半定量分析,观察电针干预对Noggin表达的影响。

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