五、综合题 1．如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆
菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。
2．你打算将一个具有KpnI末端的DNA片段克隆到具有
BamHI末端的载体中。问题是BamHI和KpnI的末端是不匹配的，BamHI是5’突出端，KpnI则是突出的3’ 端(图22．7)。一位朋友建议用图22．7所示的寡聚核苷酸“片段”来进行连接。你并没有马上意识到这种方法可行，因为你想到的连接作用需要邻近的5’磷酸和3’羟基。虽然寡聚核苷酸分子被限制性内切核酸酶切割后会产生合适的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羟基。另外，虽然图22．7中接头是BamHI-KpnI，但另一个接头却是KpnI-BamHI，你怀疑相同的寡聚核苷酸是否能够适合这两种方式的连接。 BamH I切割载体DNA
5’GATCG——————————————————G3‘ 3’C——————————————————CCTAG5‘ Kpn I 切割的片断
5’C——————GGTAC3’ 3’CATGG——————C5’ 寡聚拼接片断
——————3’G5’GATCGATC3’C5’—————— —————— C CTAGCATG G———————
—
图22．7 用一种寡聚核苷酸片段连接不互补的限
制性末端的图解
(1)画出KpnI-BamHⅡ结合体和所需要的寡聚核苷酸片
段的图，这种寡聚核苷酸与图22．7所示的是否相同?
(2)画出用连接酶处理过的分子图，指明被连接的缺口。
(3)你朋友的图解方法有效吗?
3．打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E．coli中大量制备相应的蛋白质。
这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它
从BamH[的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHI切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5’磷酸；接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。 实验中同时设置了4个对照：
对照1： 将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对照2： 将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对照3： 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的
载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上； 对照4： 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片
段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。
在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结
果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表22．2)。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长(表22．2)。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(表22．2)。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。
(1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么? (2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?
(3)对照3和4各有什么作用?
(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体? 表22．2 cDNA克隆的结果
—————————————————————————
制备的样品 实验结果
1 2 3
————————————————————————— 对照1 只有细胞 TMTC 0 0 对照2 未切的载体 TMTC 0 >1000 对照3 省去磷酸酶处理，无cDNA TMTC 0 435 对照4 无cDNA TMTC 0 25 实验样品 TMTC 0 34
————————————————————————— 注：TMTC=too many to count，多到无法计数。 4. 打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确
保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白
质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。
图22．9是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对PCR
引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另外设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。
L R D P Q G
G V I
5’-CTTAGAGACCCGCAGGGCGGCGTCATC-3’ N末端
M A T R
R A A
5’-GGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG AAG TGT-3’
L A A S L S *
C末端
答案 1．答：
要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：
(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。 (2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前
体mRNA中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。
(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的，
例如胰岛素就是通过加工去除 前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的?、?链。
(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。
针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：
①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始
密码子ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。
②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基
因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及1—2个终止密码：
ATG——————编码序列——————TGA TAG