现代分子生物学试题及答案

五、综合题 1.如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因,并使之在大肠杆

菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。

2.你打算将一个具有KpnI末端的DNA片段克隆到具有

BamHI末端的载体中。问题是BamHI和KpnI的末端是不匹配的,BamHI是5’突出端,KpnI则是突出的3’ 端(图22.7)。一位朋友建议用图22.7所示的寡聚核苷酸“片段”来进行连接。你并没有马上意识到这种方法可行,因为你想到的连接作用需要邻近的5’磷酸和3’羟基。虽然寡聚核苷酸分子被限制性内切核酸酶切割后会产生合适的末端,但是,合成的寡聚核苷酸的末端都是羟基。另外,虽然图22.7中接头是BamHI-KpnI,但另一个接头却是KpnI-BamHI,你怀疑相同的寡聚核苷酸是否能够适合这两种方式的连接。 BamH I切割载体DNA

5’GATCG——————————————————G3‘ 3’C——————————————————CCTAG5‘ Kpn I 切割的片断

5’C——————GGTAC3’ 3’CATGG——————C5’ 寡聚拼接片断

——————3’G5’GATCGATC3’C5’—————— —————— C CTAGCATG G———————

图22.7 用一种寡聚核苷酸片段连接不互补的限

制性末端的图解

(1)画出KpnI-BamHⅡ结合体和所需要的寡聚核苷酸片

段的图,这种寡聚核苷酸与图22.7所示的是否相同?

(2)画出用连接酶处理过的分子图,指明被连接的缺口。

(3)你朋友的图解方法有效吗?

3.打算将一个cDNA克隆到一个表达载体,以便在E.coli中大量制备相应的蛋白质。

这个cDNA的两侧具有BamHI的位点,因此计划将它

从BamH[的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行:载体用BamHI切割以后,立即用碱性磷酸酶处理除去5’磷酸;接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合,加入DNA连接酶后进行温育,连接之后,将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后,将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因,所以,转化的细菌能够存活。 实验中同时设置了4个对照:

对照1: 将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上;

对照2: 将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上; 对照3: 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的

载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上; 对照4: 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片

段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。

在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结

果,在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表22.2)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没有菌落生长(表22.2)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(表22.2)。从实验平板上挑出12个菌落,分离了质粒DNA,并用BamHI进行切割,其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带,另三个克隆中切出一个cDNA片段,实验终于获得成功。

(1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么? (2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?

(3)对照3和4各有什么作用?

(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体? 表22.2 cDNA克隆的结果

—————————————————————————

制备的样品 实验结果

1 2 3

————————————————————————— 对照1 只有细胞 TMTC 0 0 对照2 未切的载体 TMTC 0 >1000 对照3 省去磷酸酶处理,无cDNA TMTC 0 435 对照4 无cDNA TMTC 0 25 实验样品 TMTC 0 34

————————————————————————— 注:TMTC=too many to count,多到无法计数。 4. 打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质,以便能够大量制备这种蛋白。为确

保分离纯化,决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白

质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结合,但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。

图22.9是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对PCR

引物,各含有18个同该基因同源的核苷酸,能够用于扩增该基因的编码序列,另外,在N端有一个起始密码,其后是6个组氨酸密码子。另外设计一对引物,能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。

L R D P Q G

G V I

5’-CTTAGAGACCCGCAGGGCGGCGTCATC-3’ N末端

M A T R

R A A

5’-GGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG AAG TGT-3’

L A A S L S *

C末端

答案 1.答:

要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有:

(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。 (2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前

体mRNA中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。

(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的,

例如胰岛素就是通过加工去除 前体分子内部的33个氨基酸残基而来,剩下的两段肽链分别形成胰岛素的?、?链。

(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。

针对上述可能出现的问题,建议在克隆的过程中采取以下措施:

①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始

密码子ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。

②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基

因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外,如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列,以及1—2个终止密码:

ATG——————编码序列——————TGA TAG

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