? 第三节 细胞的破碎
欲提取存在于细胞内的物质时，必须把细胞破碎。
? 动物——细胞膜较脆弱极易破损，在组织绞碎或提取时就破坏了。
? 植物和微生物——细胞壁较牢固，需要在提取前进行专门的破细胞操作。 一、机械破碎 1．研磨法
1）用研磨棒研碎组织，可加入一定量的石英砂（45-50μm）。 2）匀浆器处理
优点：较温和，适宜实验室应用
注意：加石英砂时，对有效成分有吸附作用 细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法 2．组织捣碎器法
剧烈的破碎细胞方法。
在转速8000-10000 r／min下处理30-45秒，细胞能完全破碎。 注意：
1）加入石英砂；
2）必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性； 3）时间不易太长。 3. 超声波法
? 它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。 ? 加石英砂则可缩短时间。
? 为防止产生过多的热量，用间歇处理和降低温度的方法。 4．压榨法
? 此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。
? 用1.77×108-3.54×108 Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔（＜细胞直径的
孔），致使其被挤破、压碎。
5．冻融法
将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。 二、溶胀和自溶 1. 溶胀
? 细胞膜为天然的半透膜，低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量
进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。
? 例如，红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。 2. 自溶
? 细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称
自溶。
? 特别小心操作，水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，也可把有效成分在自溶时分
解。
三、化学处理
用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎。 四、生物酶降解
? 生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。用此法处理细菌细胞时，先是细胞
壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 ? 例如，从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用加溶菌酶（来自蛋清）破
细胞壁的步骤。
细胞破碎后：降低温度，尽快纯化，避免氧化、吸附、污染
第六节 纯化方案的设计与评价
? 纯化方案——指在纯化过程中几种纯化方法有机的联合应用的总称。 ? 它是成功地达到纯化目的的前提。纯化方案合理，就能事半功倍。 ? 一、纯化方案的设计 1. 选择纯化方法
依据：抽提液中有效成分和杂质之间理化性质的差异性
? 沉淀法—溶解度的差异 ? 离子交换层析法—电荷差异 ? 凝胶过滤法—分子量差异 ? 亲和层析—配体亲和力差异
讨论纯化效果：高活性、高回收率、高纯度、方便快速、经济 2. 可选择多种纯化方案时，纯化方法的排布应遵循的原则
1）先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法。 2）精确、费时间和需样品量少的方法应当后选用。
注意：一个纯化方案中，切忌一种方法重复使用。否则，不但不能提高纯化倍数，反而会降低回收率。
二、纯化方案的评价
是对组成纯化方案的每一个纯化方法的评价。
? 对纯化过程的每一步收集的溶液都进行有效成分的含量测定，并将比活力（活力单
位数/毫克蛋白）、纯化倍数（每步的比活力/抽提液的比活力）和回收率（每步总比活力/抽提液的总活力×100%）计算出来。
? 纯化倍数的大小，回收率的高低，就能初步确定每个纯化方法的应用价值。
? 一般认为：凡是纯化倍数大，回收率高的纯化方法是有应用价值的。但是，在纯化
过程中，随着纯化倍数的提高，有效成分的含量是逐渐降低的。
第七节 有效成分纯度和性质的分析 有效成分的纯度和性质测试与分析：
1. 鉴定纯度的方法：电泳、免疫分析、薄层层析和薄膜层析 2. 鉴定含量的方法：光谱法和气相层析
3. 测定有效成分分子量的方法：凝胶过滤和电泳法 4. 测定核酸序列的方法：化学直读法、酶解直读法
5. 测定蛋白质序列的方法：与Endman降解法相结合的薄膜层析
第二章 沉淀法 一、盐析法
原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
原因：盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。