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鱼免疫球蛋白M(IgM)酶联免疫检测试剂盒使用说明书
使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于生物素双抗体夹心技术原理，来检测鱼免疫球蛋白M(IgM)，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。
用 途： 用于鱼血清、血浆相关液体样本中免疫球蛋白M(IgM)的测定。 工作原理
本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中鱼免疫球蛋白M(IgM)的水平。向预先包被了鱼免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体的酶标孔中加入免疫球蛋白M(IgM)，加入生物素标记的抗IgM抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中鱼免疫球蛋白M(IgM)的浓度呈正相关。 试剂盒组成
1 2 3 4 5 6 标准品（8mg/ml） 标准品稀释液 酶标包被板 链霉亲和素-HRP 30倍浓缩洗涤液 生物素标记的抗- IgM抗体 0.5ml 3ml 12孔×8条 6ml 20ml 1ml 7 8 9 10 11 12 显色剂A液 显色剂B液 终止液 说明书 封板膜 密封袋 6ml 6ml 6ml 1份 2张 1个 需要而未提供的试剂和器材
1. 37℃恒温箱 2.标准规格酶标仪 3.精密移液器及一次性吸头 4.蒸馏水 5.一次性试管吸水纸 样本处理
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入0.02M浓度的PBS（PH7.4）。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 注意事项
1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋
中保存。
2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。 3． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。 4． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
5． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 6． 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。 洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml
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注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
标本要求
1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃
保存，但应避免反复冻融
操作程序
1． 标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释）：
4mg/ml 2mg/ml 1mg/ml 0.5mg/ml 0.25mg/ml （5号标准品） （4号标准品） （3号标准品） （2号标准品） （1号标准品） 120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液 120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液 120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液 120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液 120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液 2． 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量
来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3． 加样：1）空白孔：空白对照孔不加样品，生物素标记的抗IgM抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50μl，链霉素-HRP50μl（标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加）；
3)待测样品孔:加入样本40μl，然后各加入抗- IgM抗体10μl、链酶亲和素-HRP50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。
4． 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5． 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 6． 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。 7． 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
8． 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。 9.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。 操作程序总结：
准备试剂，样品和标准品 加入准备好的样品和标准品，生物素标记二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟 洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10分钟
加入终止液 10分钟之内读OD值
计算
检测范围：0.02mg/ml→6mg/ml。 规格： 96T/盒 保存： 2-8℃
有效期： 6个月（2-8℃）。
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