提取RNA步骤

实验目的:

提取动物组织RNA,备后续实验使用。

实验试剂:

研钵、镊子、刮勺、冰盒、试管架、微量移液器、RNA无酶管、低温离心机、酒精、液氮、Takara RNA提取试剂盒、去除DNA试剂盒冰袋

实验步骤:

1、实验准备:研钵中加入少量酒精,点燃,灭菌后,超净台灭菌30min(包括研钵、镊子、刮勺、试管架、微量移液器、RNA无酶管)。

2、取液氮、冰袋备、冰盒备用

3、将研钵预冷,其中大研钵的可以放在冰袋上,然后再倒入液氮,小研钵直接倒入少量液氮预冷。

4、将超低温冻结的 RNA 提取样品,剪取绿豆到黄豆大小组织(不能太大,不要大于黄豆大小),迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒,如果没有研磨彻底会影响 RNA 的收率和质量)。可用刮勺将其刮到一团。

5、可以向4的研钵中加入适量的含有裂解液的Buffer RL,(大约700ul),确保研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置(研钵倾斜放置),直至样品完全融化后用

枪头吹打混匀,只至液体中无明显沉淀。这期间可以研磨下一组织。

6、将步骤5中的匀浆液转移至1.5mlRNA无酶管中,12,000 rpm, 4℃离心 5 分钟。期间配置70%乙醇(7份无水乙醇+3份水(为试剂盒中的RNA无酶水))

7、小心吸取6步骤上清液(吸取400ul即可),移入1.5ml的RNase Free collection(切

勿吸取沉淀,否则会阻塞后面的膜)。然后向其中加入等体积的70%乙醇,此时可见沉淀,

立即摇匀。

8、将7中的混合液,取600ul(要小于600ul)到 RNA spin column (含2ml collection Tube)中,12,000 rpm, 4℃离心 1 分钟,弃滤液。将RNA spin column 放到2ml collection Tube管中。

9、将500ul buffer RWA加入至RNA spin column 12,000 rpm,4℃离心30s,弃滤液。 10、将600ul buffer RWB 沿壁加入至RNA spin column 12,000 rpm, 4℃离心30s,弃滤液。

11、消化DNA

配置DNase I 反应液: 5ul 10xDNase I Buffer, 4ul Recombinant DNase 41ul Rnase free H2O ,混合均匀。

向RNA spin column膜中央加入50ul DNase I 反应液,室温静止15min(不弃液体) 向RNA spin column 膜中央沿壁加入350ul buffer RWB,12,000 rpm, 4℃离心30s,弃滤液。

12、将600ul buffer RWB 沿壁加入至RNA spin column 12,000 rpm, 4℃离心30s,弃滤液。

13、将RNA spin column安置于2ml collection Tube管中,空管离心2min

14、将RNA spin column安置于 1.5ml的RNase Free collection (试剂盒提供),在RNA spin column 膜中央加入100ul RNA无酶水,室温静止5min,12000 4℃离心2min,洗脱RNA。

15、12000 4℃离心2min,洗脱RNA。

16、将15中的滤液体,重新吸出,加到RNA spin column 膜中央,室温静止5min,12000 4℃离心2min,洗脱RNA。

17、上述16中的滤液即RNA液。

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