第一节 酶的制备及活力测定
1．研究酶的存在和简单制作方法。
2．尝试利用酶活力测定的一般原理和方法。
一、酶的粗提取 1．提取方法
酶是在生物体活细胞中合成的。多数酶在细胞内直接参与生物化学反应，少数的酶要分泌到细胞外发挥作用。提取存在于细胞内的酶，需要破碎生物组织细胞，可用破碎仪、研磨器或匀浆器等机械将组织细胞破碎，使酶从活细胞中释放出来，进入细胞外的溶液中，经过滤、离心制备成粗酶液。唾液淀粉酶、胰蛋白酶等分泌到细胞外的酶，可以直接从动物分泌物或细胞外的组织间隙中提取。
2．提取过程中影响酶活力的因素
在酶的提取过程中，温度、酸碱性等多种环境条件都可能影响酶的空间结构，导致酶变性，直至丧失活力。
二、酶的活力
1．酶的活力检测指标
酶的活力通常以单位时间内底物的消耗量或者在单位时间内产物的生成量来表示。例如，通过测定单位时间内麦芽糖的生成量来检测淀粉酶的活力。由于麦芽糖与3,5－二硝基水杨酸试剂反应，能生成黄褐色产物，因此，利用分光光度法进行比色，可以测出麦芽糖的生成量。另外，还可以通过测定单位时间内淀粉的消耗量来检测淀粉酶的活力。
2．分光光度法
分光光度法是通过直接测定溶质对光的吸收能力来确定溶液浓度的方法。在定量分析时，首先配制一系列浓度梯度的标准溶液，在分光光度计上，选取特定的波长，测出它们的吸光值。以各种标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。比色测定待测样品时，操作条件应与绘制标准曲线时相同。测出吸光值后，从标准曲线上读出它的浓度，以计算出待测物质的含量。
三、植物淀粉酶的制备及活力测定 1．材料的选择
萌发的水稻种子是提取淀粉酶的好材料。 2．操作过程 （1）提取酶液。 （2）滴加酶液。 （3）恒温处理。 （4）钝化处理。 （5）测定吸光值。 （6）绘制标准曲线。 3．结果分析
(A－A′)×样品稀释总体积淀粉酶活力
－1－1＝ (mg·g·min)样品鲜重×V×t
式中：A为淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（在标准曲线上查得，mg）；A′为淀粉酶的对照管中的麦芽糖量（mg）；V为比色时所用样品液体积（mL）；t为酶促反应时间（min）。
四、过氧化氢酶粗酶液的制备及活力测定 1．制备过氧化氢酶粗酶液
以新鲜动物肝脏、马铃薯块茎或萝卜块根为材料，经过切碎、研磨、离心，取上清液即
可得到过氧化氢酶粗酶液。
2．分光光度法测定过氧化氢酶的活力
在过氧化氢酶存在时，过氧化氢将愈创木酚氧化生成茶褐色产物，这种产物在波长470 nm处有最大吸收峰。待酶反应终止后，过滤，取滤液适当稀释，在波长470 nm 处测吸光值，计算出过氧化氢酶的活力。
3．高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶的活力 过氧化氢酶可以催化H2O2分解为水和氧。如果在反应系统中加入适当过量的过氧化氢溶液，经酶促反应后，在酸性条件下，用标准高锰酸钾溶液滴定多余的H2O2，反应如下：
5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4―→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4 根据消耗的H2O2的量计算出过氧化氢酶的活力。
酶活力用每克鲜重样品1 min内分解H2O2的毫克数表示。
1．酶活力 所谓酶活力，指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的测定实质是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。酶反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应的速度愈快所表示的酶活力愈高。
测定酶活力，可用物理法、化学法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一，在适当的条件下，把酶和底物混合，测定生成一定量产物所需的时间，此即终点法。第二，将酶和底物混合后隔一定时间，间断地或连续地测定反应的连续变化，如吸收度的增加或减少。第三，将酶与底物混合后，让其反应一定时间，然后停止反应，定量测定底物减少或产物生成的量。
酶的活性单位（国际单位IU）：指在25 ℃下，以最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的pH等条件下，1分钟能转化1 μmol底物的酶量定为1个活性单位。
2．测定酶活力时的注意事项
（1）酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。
（2）要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的±1 ℃，pH应恒定。
（3）配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
（4）标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。有些酶在血细胞、血小板中的浓度比血清高，为此在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。
（5）在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱、蛋白沉淀剂等。
题型一 酶的特性
【例题1】酶是活细胞产生的。下列关于酶的论述，错误的是（ ）。 A．绝大多数酶是蛋白质
B．酶的数量因参与化学反应而消耗 C．酶活性与pH有关 D．酶的催化效率很高
解析：酶是活细胞产生的具有催化能力的有机物。其中绝大多数酶是蛋白质，其种类和数量的多少受基因控制，并且具有一般酶的特点，即参与一次化学反应后，立即恢复到原来的状态，继续参与反应。
答案：B
反思领悟：酶的特性是具有高效性、专一性和多样性，酶的催化作用受温度和pH的影响。
题型二 酶活力的测定
【例题2】关于淀粉酶的制备和活力测定的实验，说法错误的是（ ）。
A．提取淀粉酶最好用萌发的水稻种子，因为此时淀粉酶含量高
B．催化淀粉水解的反应要在pH＝5.6的缓冲液中进行，使反应体系的酸碱度稳定 C．淀粉与酶反应后，在测定吸光值前加NaOH的目的是中和反应体系中的酸性物质 D．在样品溶液中加入3,5－二硝基水杨酸试剂后，要在沸水浴中煮沸5 min后再比色 解析：淀粉与酶反应后，在测定吸光值前加NaOH溶液，目的是钝化酶的活性，使反应终止。
答案：C
1 下列关于酶的说法，不正确的是（ ）。
A．绝大多数酶是活细胞产生的具有催化能力的一类特殊的蛋白质，合成场所为核糖体 B．参加反应的前后，酶的化学性质不变 C．酶的活性受环境中pH和温度的影响
D．酶在细胞内才能发挥作用，离开细胞即失效
解析：酶是活细胞产生的，但酶发挥作用并不一定都在细胞内。如各类消化酶是消化腺细胞产生并分泌的，在消化道内消化有机物。
答案：D
2 酶反应速度可用哪一项来表示？（ ） A． 单位时间内反应物的减少量 B．单位体积内产物的增加量 C．单位时间内产物的增加量
D．单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量
解析：酶反应速度是衡量酶活性的参数，经常用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。
答案：D
3 同一个体内的各类活细胞所含的酶（ ）。 A．种类有差异，数量相同 B．种类有差异，数量不同 C．种类无差异，数量相同 D．种类无差异，数量不同
解析：酶的种类和数量因细胞的功能和代谢的差异而不同。 答案：B