植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳
【目的】
1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。 【概述】
1．聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
CH2CHC=ONH3CH2=CHC=OCH2CHC=O聚合作用催化剂[CH2CH]nC=ONH3+NHCH2NHC=OCH2=CHNHCH2NHC=OCH2CH[CH2CH]nC=ONH3聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：
（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH值不同。如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 （3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
③ 浓缩效应 待分离样品中各组分在浓缩胶中会被压缩成薄层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩，其原因：
a 由于两层胶孔径不同，蛋白质分子向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然增大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的蛋白区带变窄，浓度升高。
b 在凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但浓缩胶pH6.7，分离胶pH8.9，电泳槽中Tris-甘氨酸缓冲液的pH8.3。在此条件下，HCl几乎全部电离为Cl-，甘氨酸等电点为6.0，在pH6.7条件下仅有0.1%～1%解离为甘氨酸负离子，大部分蛋白质在pH6.7条件下都以负离子形式存在。电泳一开始，三种离子同向正极移动，其有效泳动率顺序为Cl-﹥蛋-﹥甘-。布满胶柱的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子，电极缓冲液中的甘氨酸走在最后，成为慢离子。由于快离子迅速向前移动，在其原来停留的那部分区域成为低离子浓度区，即电导区。
聚丙烯酰凝胶圆盘电泳除具有分离效果好的优点外，还具有设备简单、操作方便、时间短，样品用量少，不易扩散等优点，所以它是鉴定酶和蛋白质的有力工具。
2．同工酶的分离
同工酶是指生物体内能催化统一生化反应，但是由于分子结构及组成不同因而具有不同的化学性质、电泳效应等的一类酶。因此，可以利用其结构上的差异 用凝胶电泳将其分离。
过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化成蓝色或棕色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，即可显色，此有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置。其反应如下：
NH2H2N-2HNHNH-2HNH2无色H2NNHNH棕色蓝色中间产物
【材料、器材与试剂】
1．材料 绿豆芽 2．器材
（1）离心机（2）电泳槽 （3）5号注射器 （4）注射器（5）稳流稳压电泳仪 （6）洗耳球（7）研钵 （8）微量注射器（9）移液管 （10）园盘电泳槽 3．试剂
（1）溶液A 三羟甲基氨基甲烷（Tris）36g，1mol/L HCl48mL,四甲基乙二胺（TEMED）0.24ml，加水定容至100ml，pH为8.9。
（2）溶液B 丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水分别溶解，定容至100ml，pH为8.9（注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，操作中注意安全）。 （3）溶液C 过硫酸胺0.14g，加水定容至100ml（现用现配）。
（4）电极缓冲液 Tris6g,甘氨酸28.6g，加水定容至1000ml，pH为8.3（使用时稀释10倍）。
（5）样品提取液 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH为8.0。 （6）40%蔗糖
（7）联苯胺溶液 2g联苯胺溶于18mL文火加热的冰醋酸中，再加入72mL水。 （8）3%过氧化氢 【方法与步骤】
1．制备玻璃管 取玻璃管12支，长80～100mm，两端切口磨平，离管口20mm划一圈水平刻度线，洗净烘干。另一端套上塞有玻璃珠的乳胶管。 2．制备凝胶 A：B：水：C按1：2：1：4配制
将A、B及水按比例混好后置于三角瓶中，再放在真空干燥器中，同时将C液也放在真空干燥器中减压排溶液中的气泡。抽气后立即按比例加入C液，用玻璃棒轻搅使之混合。
用10ml针筒吸混匀的胶液，插入干燥、洁净下端密封的玻璃管中，一边推出溶液一边将针头自管底部逐渐向上移动，要使针尖始终在液面下，胶液灌到20mm的刻度线处。为防止空气中的氧及凝胶表面形成弯月面，应立即在其表面覆盖5mm水层。将灌好胶的玻管插入橡皮寒孔中垂直挂于电泳槽的孔内，静止30min。当见到水层下有一清楚的界面时，表明胶已聚合，用滤纸条吸去水层。拔掉玻管下的乳胶套。
3．样品的制备 称取1g绿豆芽，放入研钵中，加1ml提取液，冷水浴中研成匀浆，用1ml提取液几次洗涤移入离心管，3500rpm离心20min，上清液倒出，以等量40%蔗糖混合备用。 4．装槽点样
（1）装下槽电极缓冲液 将稀释10倍的电极缓冲液400ml倒入下槽，安好装有