实验二、法夫酵母细胞中虾青素的提取及含量的测定
一、实验目的与要求
1．学习细胞破碎的原理与方法；
2．学习与掌握有机溶剂萃取的原理与方法。 二、实验材料与试剂 1．供试菌株
法夫酵母菌液。 2．实验材料
50mL塑料离心管，Φ5mm玻璃珠，离心管架。 3．实验仪器
振荡器，水浴锅，离心机，分光光度计。 4．类胡萝卜素总量的分析方法
酵母细胞经过破壁后得到的细胞碎片用丙酮提取，测定其OD475（A）。并转化成色素含量。计算公式如下：
发酵液总类胡萝卜素质量浓度(μg/mL)=(A*V)/(E*V0 ) 细胞总类胡萝卜素含量(μg/gCDW)=(A*V)/(E*G) 式中： A —吸光度读数；
V —萃取液体积数，mL； E —消光系数，0. 16；
Vo—吸取的酵母定容液的体积，mL； G —发酵液的细胞干重（CDW），g。
5．菌体生物量的测定方法：吸取4mL的发酵液，3000rpm离心10min，等量蒸馏水洗涤一次，80℃烘干至恒重。 6．HPLC测定虾青素的含量
准确称取经冷冻干燥的25mg法夫酵母细胞，加入56℃二甲亚砜（DMSO）6mL振荡10min，加6mL丙酮振荡2min，加入6mL 20%NaCl溶液，然后加入18mL混合萃取溶剂正己烷/乙醚(1: 1)振荡1min后，5000rpm离心5min，旋转蒸发浓缩上层红色液体至溶剂消失后，先用少量氯仿溶解颗粒物，移至25mL的容量瓶中并用流动相定容。
精密称取5mg 虾青素（Sigma公司）标准品，少量氯仿溶解后用流动相制成0. 02 mg/mL的标准溶液进行进样。按外标法计算。色谱条件：色谱柱为 Agilent Eclipse XDB-C18：5μm，4.6×250mm；流动相：甲醇:乙腈= 9:1；流速0.8mL/min；检测波长475nm；柱温为室温，进样量为20μL。 三、实验内容
1．自溶法：准确吸取4mL菌液，3000r/min离心3min后弃上清，水洗一次，沉淀加入4%的NaCl 4mL，作为质壁分离剂，水浴控制温度为55℃，自溶1h后，3000rpm离心3min，即得破壁的酵母细胞，再加入8mL丙酮萃取色素，振荡2min，3000rpm离心3min，上清以丙酮作空白测OD475。
2．二甲亚砜法：准确吸取4mL菌液，3000r/min离心3min后弃上清，水洗一次，加入10颗玻璃珠，加入55℃二甲亚砜（DMSO）4mL，振荡5min，依次加入4mL丙酮，4mL 20% NaCl溶液和8mL石油醚，振荡1min，3000rpm离心3min。上清以二甲亚砜:丙酮:20%NaCl:石油醚＝1:1:1:2作为空白测定OD475。
3．酸热法：准确吸取4mL菌液，3000r/min离心3min后弃上清，水洗一次，加入3mol/L HCl 4mL，沸水浴3min，3000rpm离心3min，取沉淀用8mL丙酮萃取色素，振荡2min，3000rpm离心3min，上清以丙酮作空白测OD475。 四、实验注意事项
1．严格控制酸破壁时沸水浴的时间，沸水浴后及时冷却。 2．DMSO在55℃预热。
3．加入石油醚提取虾青素时，需加20%氯化钠破乳化。 4．分光光度计测定虾青素含量时，石油醚作空白防止混入水。
5．比色杯始终用一个以消除误差。比色皿使用前后浸泡在无水乙醇中，使用水和有机溶剂时用无水乙醇过渡。