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本次实验项目： 本次实验课时：10学时 实验类型：综合性 动物肝脏DNA的提取及检测 教学要求： 1．掌握实验原理 2．知道提取DNA要去除的物质，各步操作要规范，能够提取出DNA。 3．掌握琼脂糖凝胶电泳的实验操作技术 重 点：各步操作要规范，能够提取出DNA。能够用电泳方法检测出所提的DNA。 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。 讲授内容及时间分配： 课堂讲授 1．相关知识…………………………………………………………… …… 0.1 学时 2．实验目的………………………………………………………………… … 0.3学时 3．实验原理…………………………………………………………………… 0.3 学时 4．实验操作 …………………………………………………… … 0.3 学时 实验教学 动物肝脏DNA的提取及检测实验的操作技术……………………… …… 9 学时 参考资料 《分子生物学实验》
综合性、设计性实验基本信息表
学院名称 课程名称 实验名称 实验性质（√） 实验目的： 根据教师提供的实验条件，了解并掌握提取基因组DNA的原理和技术。能够从动物肝脏中提取DNA粗品，并能够用琼脂糖凝胶电泳法检测所提DNA。对实验结果做出正确定的分析。 生物科学与工程学院 生物化学 实验室名称 面向专业 生物化学实验室 生物科学、生物技术 大纲规定 学时数 动物肝脏中DNA的提取及检测 □综合性√ □设计性 10 10 实开学时数 实验要求： 实验性质及依1． 根据教师给准备的实验材料、实验仪器和试剂，结合实验目的进行整个实验过程在实验前做好预习； 2． 做好每步实验结果的记录，根据原始记录，对实验结果做出正确分析，写好实验报告； 写出本实验成功与失败的原因。 实验内容： 第一部分：动物肝脏中DNA的提取 第二部分：DNA琼脂糖凝胶电泳 据 认定依据：本实验内容所涉及本课程综合知识包括以下几方面： 1. 蛋白质变性作用、变性剂和酶的抑制剂。 2. 细胞膜蛋白的裂解、核蛋白体的解离。 3. EDTA、SDS、蛋白酶K的作用。 4．DNA的理化性质、DNA片段的大小表示方法、DNA与染料分子EB的结合。 5. 琼脂糖凝胶浓度的选择及配制。 6．电泳知识及影响电泳样品迁移率的因素。 实验项目设计人签字：李敏 2007年5 月10 日 专家组认定意见 专家组组长： 年 月 日 学 院 意 见 盖章 年 月 日 职能部门意见 盖章 年 月 日
动物肝脏DNA的提取及检测（综合性）
相关知识
1．蛋白质变性作用，变性剂和酶的抑制剂
2．EDTA、SDS、蛋白酶K的作用、DNA的理化性质：溶解特性 ３．影响电泳迁移率的因素
４．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度
0.3
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-4
2.0 0.1-3
线状DNA大小/kb 5-60
５．核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。 ６．琼脂糖凝胶电泳的特点
天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。
②琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由 电
流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 ④电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 ７．常用染料EB（溴化乙锭Ethidium Bromide，EB）：
溴乙锭染料全名是3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐，是诱变剂，可与核酸结合，在紫外光下呈黄色荧光。使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。
①在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。在适当的下，荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。
可插入碱基与碱基之间造成移码突变。 DNA（RNA）定量 分析：可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致 表示DNA（RNA）量的多少。 ８．提纯的思路
①基因组DNA的特性：分子量较大、所提取的DNA片段的大小：100 — 150kb，易断（如何