β-N-乙酰葡萄糖苷酶(NAG)检测试剂盒(PNP微板法)

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β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP微板法)

简介:

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)可水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷,也能水解β-N-乙酰氨基半乳糖苷,该酶广泛存在于多种组织、体液、细胞,是溶酶体中的一种酸性水解酶,其测定方法有比色法和荧光光度法。

Leagene β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP微板)(NAG Colorimetric Assay Kit)检测原理是在酸性条件下NAG可使底物对硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷水解,释放出游离的对硝基酚(p-nitrophenol,PNP),在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色产物,产物黄色越深,说明β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性越高,反之则酶活性越低,通过酶标仪测定处吸光值,据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

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组成:

自备材料:

1、 96孔板 2、 恒温箱 3、 酶标仪

编号 名称 TE0061 50T 7.5ml 1支 0.05ml 0.05ml 1ml Storage 试剂(A): NAG Assay buffer 试剂(B): 4-NAG 试剂(C): Alkaline buffer 试剂(D): p-nitrophenol(10mM) 试剂(E): ddH2O 使用说明书 4℃ -20℃ 避光 4℃ -20℃ 避光 RT 1份 操作步骤(仅供参考):

1、 配制检测工作液:

① 配制显色工作液: 取出4-NAG,恢复至室温后溶解于NAG Assay buffer,混匀,

冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在10天内用完。

② 配制标准品工作液:取出p-nitrophenol(10mM) 恢复至室温后,取溶解于ACP

Assay buffer,使p-nitrophenol达到。

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2、 制备标准曲线:

① 按照下表稀释系列标准品溶液。

1 0.5 9.5 10 2 1 9 20 3 1.5 8.5 30 4 2 8 40 5 2.5 7.5 50 6 3 7 60 p-nitrophenol(3mM)(μl) ddH2O(μl) 相当于NAG单位(U/L) ② 以试剂空白对照(以ddH2O代替标准液)调零,读取系列标准溶液的处吸光值即

A401。该步骤可同待测样品一起操作。

③ 以每个浓度的标准品A401为x轴,以对应的p-nitrophenol浓度为y轴,用Excel

制作p-nitrophenol浓度对A401值的标准曲线。

3、 准备样品:

① 细胞或组织样品:取恰当细胞或组织裂解液,如果有必要需进行适当匀浆,低速离

心取上清,冻存,用于β-N-乙酰葡萄糖苷酶的检测。

② 血清和尿液样品:血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,尿液通

常也可以直接用于测定,冻存,但为了消除样品本身颜色的干扰,需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。

③ 高活性样品:如果样品中含有较高活性的β-N-乙酰葡萄糖苷酶,可以使用原有的裂

解液或PBS等进行稀释,也可以采用NAG Assay buffer稀释。

4、 加样:按照下表设置96孔板样品空白对照、标准品、待测样品,溶液应按照顺序依次

加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行孔。 5、 按

待测样品 ddH2O 样品空白对照孔 8μl 37℃温育平衡3min。 显色工作液(37℃提前温育) 50μl 50μl 50μl — — 8μl — 标准品孔 待测样品孔 37℃孵育15~20min。 Alkaline buffer 标准品工作液 160μl — 160μl 8μl 160μl — 照

上表每孔加入相应待测样品或标准品后,温育平衡。

6、 加入显色工作液,轻轻混匀,37℃孵育,加入Alkaline buffer显色。

7、 用ddH2O调零,读取待测样品孔和空白调零孔的吸光度(即A待测和A空白),如果无法

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检测,亦可检测吸光度,一般应数小时内检测完毕。A待测-A空白的差值为实际的吸光度,用该差值与标准曲线进行对比。

计算结果:β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性单位的定义:1L样品与底物在 37℃条件下,每分

钟水解4-NAG显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的β-N-乙酰葡萄糖苷酶的量定义为一个酶活力单位(1U/L)。根据酶活性定义,计算出样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。

注意事项:

1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂,同时需避免反复冻融。

2、 建议每次测定时都做标准曲线,以使标准更准确,另外标准品需避免反复冻融。 3、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但应考虑根据比色杯的最小检

测体积,尽量采用小体积的比色杯。

4、 用窄带宽分光光度计,吸光度至1.0或酶活性达90U/L时仍为直线;用用窄带宽分光

光度计,吸光度至0.6或酶活性达60U/L时仍为直线。超出此范围应用生理盐水稀释样品后重新测定,结果乘以稀释倍数。

5、 一支显色工作液配制后需当日使用完毕,因此请注意适当多准备一些样品一起检测。 6、 尿β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性以肌酐比值“NAG(U/gCr)”计算酶排出率,这样既不因

为尿浓缩或稀释的影响而改变,又可不需留24h尿

7、 p-nitrophenol溶液对人体有害,反应终止液有腐蚀性,请小心操作。

8、 如果希望进行酶活性的绝对定量,进行酶反应时应精确计时,此时推荐采用孵育30min

或更长时间,以减小操作过程中的时间误差。

9、 待测样品中酸性磷酸酶活性较低时,可适当延长孵育时间至30min。

有效期:12个月有效。

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