第四章 DNA的复制
第四章 DNA复制 (DNA Replication) 1．主要内容 1) DNA复制概览 2) 细菌DNA复制 3) 真核DNA复制 2．教学要求
1) 掌握原核生物和真核生物DNA的复制特点 2) 熟悉原核生物和真核生物DNA复制的酶系统
第一节 DNA复制概述 第二节 DNA复制的酶学 第三节 原核生物DNA复制 第四节 真核生物DNA复制
第一节 DNA复制概述 (DNA Replication: An Overview) 一、基本概念
二、DNA的半保留复制 三、复制起点、方式和方向 四、DNA复制的半不连续性
一、基本概念
复制子(Replicon，复制单位或复制元)?
DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。 1.3万— 90万不等
A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator 复制体(Replisome)：复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA。?
The multi? protein (30±) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA 二、DNA的半保留复制
（Semi-Conservation Replication）
CsCl (Cesium chloride) density gradient ultracentrifugation（ CsCl密度梯度超离心） Labeled E.Coli DNA with 15N 14N? 三、复制起点、方向和方式
? All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications. （单复制子）
1、复制起点（origin，ori 或 O，复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置 原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即——整个染色体只有一个复制单位 真核生物（Eukaryote）： 多复制起点，即－－一个genome中有多个复制单位 2、复制方向（复制过程的顺序性） 复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点 复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛 真核生物的多复制子 多个复制眼
（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉 （2） 复制的多模式 单起点、单方向（原核） 多起点、单方向（真核） 单起点、双方向(原核) 多起点、双方向（真核）
3、复制方式
（1） 从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式（ replication fork ） （2） 置换式（ Displacement form）又称 D 环复制
（3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication） DNA复制方式
（1）从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式（ replication fork ）或θ 复制 A replication eye forms a theta structure in circular DNA.?
（2） 置换式 Displacement form ，又称 D 环复制 线粒体和叶绿体 DNA的复制方式
（3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication） 由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制 病毒、细菌因子
四、DNA复制的半不连续性
（Semi-Discontinuous Replication） 复制方向的问题：
冈崎片段（Okazaki fragment）
1968年冈崎（Reiji Okazaki）设计了两组实验，其一是脉冲标记实验（pilse－labeling experiment）。冈崎利用T4噬菌体侵染E.cili(t-)菌株，并分别用dTTP(3H-T)进行2’’，7’’,15’’,30’’,60’’,120’’的脉冲标记，分离提取T4噬菌体DNA，变性后，进行Cscl密度梯度离心，以检测具放射性的沉降片断，判断片断大小。结果表明经不同标记时间的，被3H-T标记的新合成的DNA片段几乎都为10-20s，即均为1000-2000核苷酸大小（图3-）。第二组实验是脉冲追踪实验（pulse－chase experiment），为了研究在脉冲标记实验中所发现的10－20s的小片段在复制全过程中的发展结局，冈崎将实验菌株先进行同位素标记培养30秒，然后转入正常培养基继续培养数分钟，分离DNA进行密度梯度离心，发现小片段已被连接成为70－120S的大片段。为此将DNA的这种复制方式称为不连续复制模式，将最初合成的10－20s片段称为冈崎片段（图3－）。
如果两条极性单链的DNA复制均按这种不连续的模式进行，后随链的合成可以在模板单链暴露到1000－2000核苷酸长度后，开始从5’ → 3’合成冈崎片段，而先导链的合成从进化的原则讲，大可不必按冈崎片段的模式不断地启动小片段的合成，既耗时又费能。换言之, DNA的复制应该是按一种半不连续的方式进行，即先导链以连续复制的方式完成子代DNA的合成，而后随链以不连续复制的方式完成冈崎片段的合成。但在Okazaki的脉冲标记实验结果中，被标记的DNA全部为小片段。 其实在E.coli的细胞内存在dUTP和dTTP两种类似物, 其比例大约为1：300，而DNA聚合酶III又不能区分这两者，一旦将dUMP聚合到DNA分子中，必然会导致生物的基因表达与进化过程中的潜在危险，实际上E.coli 依靠了两种机制阻止了dUMP 掺入到DNA分子的过程。由dut基因编码的dUTP酶（dUTPase）能有效地将dUTP，dUDP分解为dUMP,从而避免了dUMP作为底物而掺入到DNA分子中。即使dUTPase能将绝大部分的dUTP降解，但仍有约1／1200的几率dUTP分子的
逃逸，细胞内的ung基因编码的尿嘧啶－N－糖苷酶（ungase）可以迅速地将已经掺入到DNA分子中的dUMP切除，形成一个无嘌呤或嘧啶的Ap位点（apurinic 或apyrimidinic），再由Ap内切酶进一步将Ap位点酶解成缺口，以与其对应的亲代链为模板 重新聚合和连接，完成切补修复过程.
显然在先导链合成的初期过程中，约1200个核苷酸就有一个dUMP被切除的可能，在Ap内切酶未完全作用前提取DNA并进行变性分析，就会得到与冈崎片段相似大小的1000－2000核苷酸的片段，这种片段也被称为dUMP片段，Okazaki对dut－和ung－两种突变体的研究结果证实。在dut－突变体的脉冲标记实验中，由于dUMP掺入的几率增加，冈崎片段变短。而在ung－突变体的脉冲标记实验中，由于已掺入的dUMP被切除的几率降低，冈崎片段变长。冈崎选用连接酶突变体（lig-）进行的脉冲追踪实验中，先导链的dUMP片段均不能被连接成大片段，（图3－）。进一步证明了在脉冲标记实验中后随链的冈崎片段与先导链的dUMP片段均以相似大小表现在其研究结果中。1978年Olivera据此提出了DNA复制的半不连续模式。
第二节 DNA复制的酶学(Enzymology of DNA Replication)
复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质共同参与. DNA复制的体系
底物： dNTP(dATP dGTP dCTP dTTP)
聚合酶（polymerase): DNA-pol 依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP) 模板（template): 解开成单链的DNA母链
引物（primer): 寡核苷酸片段,提供3’-OH末端,使dNTP聚合 其它酶和蛋白质因子: 解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶 一、DNA聚合酶
二、DNA连接酶（DNA Ligase） 三、与DNA几何学性质相关的酶
一、DNA聚合酶
催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。 (一) DNA聚合酶催化的反应 5′→3′的聚合活性 5′→3′外切酶活性 3′→5′外切酶活性 1、5′至3′的聚合活性
催化四种dNTP以磷酸二酯键一个一个地接到DNA链上去 (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi 聚合反应的特点：
(1) 以单链DNA为模板 (2) 以dNTP为原料
(3) 引物或DNA链提供3′-OH (4) 聚合方向为5′→3′ 2、 3’－5’ 外切核酸酶活性 校对功能(proofreading) 3、 5’－3’外切核酸酶活性