胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定
刘亭 2016.7.21
目录
前言................................................................ 2 1分离制备PMSC组织的选取 ........................................... 3 2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 ........................................ 5
2.1胎盘组织的获取，存储与清洗................................... 5 2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 .............................. 6 3 原代培养和继代培养............................................... 10
3-1培养基...................................................... 10 3-2培养密度.................................................... 11 3-3培养条件.................................................... 11 3-4换液........................................................ 11 3-5 传代培养 ................................................... 12 3-6细胞形态与生长速度.......................................... 12 3-7 MSC的冻存与复苏：.......................................... 12 4细胞表面抗原检测 ................................................. 13 5生长曲线 ......................................................... 13 6细胞周期 ......................................................... 13 7分化潜能 ......................................................... 13 参考文献........................................................... 13 附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法....... 15
脐带血 ......................................................... 15 脐带 ........................................................... 15 羊膜 ........................................................... 17 绒毛膜 ......................................................... 18 蜕膜层 ......................................................... 18 胎盘 ........................................................... 19 整体灌注法 ..................................................... 20 附件2 背景知识 .................................................... 20 附件3 PMSC实验所需试剂............................................ 21
1
前言
干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力。但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。MSC是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状。胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁。在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成包括三个胚层的各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。
MSC具有低的免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节和造血支持等功能，而且易于外源基因导入表达，是基因治疗中重要的载体细胞。此外，一些研究学者还发现，MSC具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制T细胞的异基因增殖反应。所以，MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛的应用前景。近年来MSC已逐步成为干细胞研究的热点（张慧娟等，2014）。
目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每105-106个单个核细胞中大约只有1个；而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。其他组织中，如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干
2
细胞，然而，从这些组织中获得的细胞数量较为有限。以上因素，都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的运用。
目前胎盘或脐带属于临床废弃物，容易获得，并且无污染，取材研究和应用基本无伦理学争议，研究表明胎盘或脐带含有丰富的MSC。有研究表明PMSC比骨髓间充质干细胞更容易分离培养，细胞活性更好，还可诱导分化成脂肪，成骨等多种细胞。并且这些胎盘源的间充质干细胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs）具有极低的免疫原性，大多数患者对于胎盘或脐带间充质干细胞具有天然的免疫耐受，因此，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中，即便是人-动物模型间的异种间移植，由于存在天然的免疫耐受，对实验研究的结果影响甚小，这对于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。
目前MSC主要临床应用于抑制移植物抗宿主反应。动物模型研究结果表明PMSC对子宫内膜损伤（刘芳，2013），大鼠肝组织损伤（宫黎明等，2011），APP+转基因鼠阿尔茨海默病（郭亚男等，2009）均有疗效，也可以用于构建组织工程皮肤（徐彪等，2013）。所以，综合充分利用胎盘和脐带作为间充质干细胞新来源，优化分离纯化以及传代培养条件，加快细胞繁殖速度，降低培养成本以高效率获取大量的PMSC对于的各种疾病实验研究及医院各个科室的临床应用，都具有重要意义。
1分离制备PMSC组织的选取
胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，人足月娩出的胎盘由羊膜层、绒毛膜层和蜕膜层组成。从脐带血（于海微等，2009；管英华等，2011），脐带（徐燕等，2009；韩之波等，2012；管英华等，2011；李艳琪等，2014；赵琳等，2016），整个胎盘（陆琰等，2009；沙文琼等，2010；刘洋等，2015；赖平等，2016），胎盘的羊膜层（宫黎明等，2011；徐彪等，2013；张慧娟等，2014；丛姗等，2015），绒毛膜层（洪艳等，2014；韩之波等，2012）和蜕膜层（韩之波等，2013）分离培养MSC均有报道。目前大多数研究者取胎盘小叶（包括绒毛层和绒毛滋养层）进行分离（洪艳等，2014）。胎盘的细胞成分较复杂，既有滋养细胞，也有间质细胞、血管内皮细胞和Hofbauer细胞（沙文琼等，2010）。由胎盘组织分离制备
3
MSC时不可避免会有其它细胞的干扰（苗宗宁等，2009），其中以数量最多的血细胞干扰为主。分离MSC选取组织时需要考虑哪个部位的组织可能含有最多的MSC，并且尽可能降低其它种类细胞的干扰，以获得纯度高，活力强的MSC。
对于人脐带血来源的MSC（human umbilical cord blood MSC, hUCB-MSC）的存在及能否稳定传代扩增，曾有一定争议，后来的实验结果证实脐带血中存在MSC，并表明脐带血来源MSC与骨髓来源MSC具有相同的生物学特性及功能特征（于海微等，2009）。但是脐带血中也存在多能成体干/祖细胞，分离间充质干细胞的过程以丢失造血干细胞为代价，而且个体差异大（徐燕等，2009）。
脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是Wharton’s Jelly，外层由羊膜来源的上皮包裹，从发育角度来说，脐带是干细胞形成及所经通路（管英华等，2011）。不同研究机构均从人脐带组织中分离到MSC（human umbilical cord MSC, hUC-MSC）。已有研究表明人脐带的结缔组织是间充质干细胞丰富的组织来源（徐燕等，2009），故制备hUC-MSC一般剥离脐带动静脉和外层上皮。
管英华等（2011）比较了脐血和脐带两种来源的MSC原代培养过程，结果表明脐血中细胞成分复杂，原代培养多见成纤维样和大圆形破骨样两种形态的贴壁细胞，随着换液和传代破骨样细胞逐渐减少和消失，剩下形态较为单一的呈漩涡样的细胞集落; 脐带来源培养的贴壁细胞不会随换液丢失，且细胞形态以成纤维样细胞为主，种类单一。hUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培养的时间短，培养成功率明显增高。
羊膜是胎膜最内层，胎盘包裹胎儿面的一层薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁发育而成，在胎盘面与绒毛膜相贴，由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织。人羊膜间充质细胞来源于原条期的胚胎中胚层，而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层。越来越多的研究已证实，人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞都具有干细胞的特征。其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞（human amnion-derived mesenchymal cells, hAD-MSCs）不但表达成体干细胞特性中的间充质干细胞特性也表达部分胚胎干细胞特性，相关研究表明人羊膜间充质干细胞表达胚胎干细胞全能型标志转录因子基因OCT4、SOX2和NANOG（张惠娟等，2014）以及SSEA-3、SSEA-4、Oct-4等胚性标志（宫黎明等，2011），近年来发现hAD-MSCs在体外诱导培养条件下，可分化成来自3个
4
胚层的所有细胞（宫黎明等，2011）。有研究比较人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖能力，发现培养人羊膜间充质干细胞的细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞（徐彪等，2013）。
洪艳等（2014）分别从绒毛膜和绒毛滋养层分离并培养MSC，发现在分离过程中，从绒毛膜和绒毛滋养层得到的细胞量都很多，绒毛滋养层的细胞量甚至会超越绒毛膜的细胞量。但是在接种后培养时，由于绒毛滋养层血细胞较多，血细胞难以处理，影响间充质干细胞的贴壁，无法贴壁就无法继续生长，由此导致后期细胞生长慢，收获细胞少。
韩之波等（2013）的研究表明来自母体的底蜕膜组织也可以分离制备MSC。 苗宗宁等（2009）将胎盘组织分为3 组，分别是中央带组即脐带附着处，边缘带组即距脐带附着点最远处和中间带组即两者之间中点处。分别全层连续切片，以抗CD166、抗CD44、抗CD29 分别做免疫荧光和免疫组织化学染色，显微镜下观察阳性细胞表达及分布分布区域，结果表明中间层的阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层和底板层；同为中间层，中央带较中间带及边缘带表达更强。由此推测，在接近血管丰富的脐带附着部的胎盘中间层取材易于获得较丰富的PMSCs。
2脐带，胎盘MSC的分离与纯化
2.1胎盘组织的获取，存储与清洗
母血检测 HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性。产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病。临床足月正常剖宫产后胎盘，大小及质量在正常范围内，胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位。经与产妇及其家属签署知情同意书，实验方案经并经医院伦理委员会批准。在产房无菌条件下获取脐带，胎盘。
文献报道中取组织后有如下处理方法：
立即浸入胎盘储存袋（加拿大LABPLAS公司的无菌采样袋，含99%低糖DMEM，1%双抗即青链霉素的组织保护液），在48 h内转移至实验室。
脐带静置于４℃冰箱12h， 观察保存脐带的PBS液， 若无浑浊说明无感染。 脐带采集后在6 h内进行处理，切除双侧带夹痕及淤血的部分。
5