链霉素发酵工艺验证方案要点

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链霉素发酵工艺验证方案

1.

目的:

确认链霉素发酵系统工艺流程,确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺,验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备 的发酵液能否达到中间体规格要求。

2. 范围:

此方案包括一个50吨大罐链霉素发酵液的生产过程。

2.1 验证地点:

403车间发酵工段:

2.2 验证对象: 2.2.1 原斜面

2.2.2 代1、代2斜面 2.2.3 母瓶 2.2.4 子瓶 2.2.5 小小罐 2.2.6 小罐 2.2.7 中罐 2.2.8 大罐

2.3 验证步骤:

确定验证方案,确定验证计划,内容、步骤,以便准确验证链霉素发酵系统。

3. 验证措施概要: 3.1 生产记录:

原斜面:冷藏期≤10天

外观无菌

外观集落:白色丰满、正常

代1或代2斜面:冷藏期≤14天

外观无菌

外观集落:白色丰满、正常

母瓶:无菌斜面及外观无菌

菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝 效价68小时≥1700u/ml 效价96小时≥3500u/ml 效价120小时≥6700u/ml 冷藏期≤5天 菌龄50~64小时 菌丝II—III

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子瓶:无菌斜面及外观无菌

菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝 效价120小时≥7000u/ml 效价144小时≥7500u/ml 冷藏期≤7天 菌龄30~44小时 菌丝II—III

小小罐:菌丝II—III

镜检无菌

放罐效价≥800u/ml,残C≤3.5g/100ml,残N≤140mg/100ml,PH≤7.5

小罐:菌丝II—III

镜检无菌

放罐效价≥1200u/ml,残C≤3.5g/100ml,残N≤140mg/100ml, PH≤7.5

中罐:菌丝II—III

镜检无菌

放罐效价≥1800u/ml,残C≤3.5g/100ml,残N≤140mg/100ml, PH≤7.5

大罐:放罐残糖≤2.0克/100毫升

放罐残氮≤120毫克/100毫升 放罐透光度≥40%

放罐效价≥14000u/ml

3.2 原材料:

生产过程中所用的各种原材料及其规格(见原材料一览表)

3.3 设备:

生产链霉素所及设备见设备一览表。

3.4 以上所及设备的每一部分,必须在本次验证前确保经过适当鉴定

(IQ/OQ),并且任何相关的测试装置经过校正。

3.5 人员培训,作为验证研究的一部分,涉及生产链霉素发酵的每位职工

均经GMP及有关岗位SOP培训。

4. 生产程序和流程表: 4.1 生产过程的描述:

4.1.1 我厂用于生物合成链霉素的生产菌种为灰色链霉菌,为了保持菌种的

生命活力和稳定性,将孢子保存于干燥的沙土内冷藏在2~4℃冰库内,或者将孢子制成牛奶悬浊液,密闭冷藏于~196℃液氮中。

每年对生产菌株进行两次自然分离,控制菌落变异率≤5%,并进行菌丝八代遗传稳定性考查,考查其母、子代谢及效价单位的稳定性。

挖取清洁海滩细沙(不能污染各种有机物),用自来水漂洗清洁,

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洗至漂出来的水澄清不浑浊为止,烘干、100目筛子过筛,用磁铁充分吸尽砂内铁屑备用,挖取郊区地面二尺深处的黄土(不能污染各种有机物),用自来水充分漂洗消毒,洗至漂出来的水澄清为止,烘干,120目筛子过筛,用磁铁充分吸尽土内铁屑备用。以上处理的砂和土,按土一份,砂二份比例混合,分装于玻璃试管(12×100mm),每支装1g,用纱布棉塞塞紧置于小铜线筐中,放消毒锅消毒,间歇灭菌三次,每次压力0.12MPa,温度122℃,时间1小时,消毒后置电烘箱烘干,110~120℃、4-5小时,外表明批号、日期备用,使用前为确保无菌起见,应按以上要求再消毒烘干一次。

取符合质量要求的孢子斜面一支,在无菌操作下,加入0.85%氯化钠无菌生理盐水1ml左右,用1#棒将表面孢子轻轻刮下(防止用力过重划破琼脂)摇匀,用1ml割头无菌吸管吸出,准确仔细地在每支无菌空白砂土管内加0.1ml孢子液(加入时应注意将吸管伸至接近沙土处,但又不能接触沙土,也不能使吸管口接触沙土管口及内壁)。塞紧棉塞,将沙土敲松摊开,放在真空干燥器内(干燥器内放置氯化钙干燥剂)保持真空度0.10MPa,抽4支时维持抽干4小时,抽5支或以上时,抽干时间酌情增加,取出抽干的沙土孢子,敲松放在盛有无水氯化钙的广口瓶中盖紧密封,放2~4℃冰库中保存备用。使用时采用干接法接种。孢子沙土管有效使用期为2年。

市售新鲜牛奶离心三次,3000rpm,15分钟弃去上层脂肪,将脱脂牛奶置试管内115℃~117℃,0.07MPa,15-20分钟消毒。

将空白安培管洗净烘干,塞好棉花,置于消毒锅内121℃,60分钟,间隙灭菌三次,待用。

取符合质量要求的孢子斜面一支,加入无菌脱脂牛奶5~10ml,用2#棒轻轻将孢子刮下,用无菌吸管吸孢子牛奶悬浊液置灭菌珠子瓶,振摇10分钟,然后用1ml 无菌吸管将珠子瓶内的孢子牛奶悬浊液加入无菌安培管中,0.3ml/支,做好标记存置于液氮中保存,存放有效期5年。

4.1.2 种子组洁净工作台洁净等级100级,每三个月对尘埃粒子(≥0.5u的

尘埃≤3.5粒/1L空气)、风速(≥0.35m/s)、无菌(定点开启双碟30分钟≤1个/碟)进行测定。平时每次操作定点放置定点开启双碟30分钟,控制杂菌菌落≤1个/碟。每天用前紫外光消毒一小时,每三个月调换消毒剂(1/600洁尔灭、75%酒精)。

4.1.3 孢子斜面:

取生产用之孢子沙土管或孢子冷冻管在无菌室内,用操作棒勺取适量孢子接种于斜面培养基上,尽量将孢子涂开使长单个集落,然后于27±1℃恒温室内培养6—7天,该生长成之孢子斜面称为原斜面,仅作孢子传代使用,不能制备母瓶,液氮冷冻孢子接出原斜面。根据质量情况可酌量考虑制作母瓶,有效使用期在2—4℃冷藏中不超过10天。

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