谷氨酸摇瓶发酵
生物工程xxx xxx xxxxxxxxx
摘要 根据谷氨酸的发酵机理，本实验通过摇瓶补料发酵生产谷氨酸，并对发酵过程中产谷氨酸量、发酵液OD值、残糖量进行连续的测定。试验结果表明：四瓶发酵培养基中，只有添加有玉米浆的发酵培养基产谷氨酸，另外3瓶以酵母膏代替玉米浆成分的发酵液都不产谷氨酸。 关键词：谷氨酸 发酵 摇瓶培养
前言
1.1 谷氨酸发酵机制
在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反应有三种：（1）谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应；（2）转氨酶（AT）催化的转氨反应；（3）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应。
谷氨酸的合成主要途径是α—酮戊二酸的还原性氨基化，是通过谷氨酸脱氢酶完成的。α—酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体，它来源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间代谢产物。由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径如下图1所示，至少有16步酶促反应。
图1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制
在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。 1.2 谷氨酸生产菌种的选择
目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌、天津短杆菌等。为革兰氏阳性菌，菌体为球形、短杆状和棒状，不同形状芽孢，没有鞭毛，不能运动，需要生物素作为生长因子，在通气条件下才能生产谷氨酸。本实验选择天津短杆菌来摇瓶发酵生产谷氨酸。 1.3 谷氨酸发酵过程控制
谷氨酸发酵过程中，产生菌种的特性、生物素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。在实际生产中只有针对存在的问题，严格控制工艺条件，才能达到稳产、高产的目的。
发酵初期，菌体生长迟滞，约2～4h后即进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的pH 值至7.5～8.0，同时保持温度为30～32℃。本阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，菌体内生物素含量由丰富转为贫乏，时间约12h。
随后转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α- 酮戊二酸和氨主要用来合
成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成最适pH 7.2～7.4，需大量通气，并将温度提高到谷氨酸合成最适温度34～37℃。
发酵后期，菌体衰老，糖耗慢，残糖低，这时应减少流加尿素量。当营养物质耗尽，谷氨酸浓度不再增加时，及时放罐，发酵周期约为30 h。
材料和方法
2.1 菌种选择：天津短杆菌。 2.2 实验器皿的准备：
带10ml刻度的比色管24支，离心管12个，枪头灭菌并烘干（80℃烘4小时）约200支，灭菌移液管1ml5支。
2.3 配置培养基及相关试剂： 2.3.1活化斜面培养基（g/L）（5支，10ml/支）
葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl12.5，琼脂15～20，Ph7.0～7.2，分装大试管约10ml/支，灭菌：115℃，25min，斜面高度占试管高度的2/3。
2.3.2种子培养基（g/L）（2瓶，30ml/瓶）
葡萄糖26，玉米浆40，K2HPO41.4，MgSO40.8，20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml培养基（终浓度0.8%，接种前在无菌室加入），分装30ml/500ml三角瓶，灭菌：115℃,25min。在无菌室加入尿素后调节pH7.0～7.2。
2.3.3摇瓶发酵培养基（g/L）（6瓶，30ml/瓶）
葡萄糖70/80/90，玉米浆（或酵母膏）3，MgSO40.8，K2HPO43.5，K,H2PO41，20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml培养基（终浓度0.8%，接种前在无菌室加入），分装26ml/500ml三角瓶，灭菌：115℃,25min。在无菌室加入尿素后调节pH7.2～7.5。
2.3.4相关试剂的配制
1）0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl溶于蒸馏水并定溶至100ml。
2)50%葡萄糖配法：称取50g葡萄糖溶于蒸馏水并定溶至100ml，用于补料。 3）20%尿素：称取22g尿素溶于蒸馏水并定溶至100ml，过滤除菌。
4）3mol/LHCl：取12mol/L浓HCl，令HCl:H2O为1:3（体积比）配制100ml。 5）2mol/LNaOH：称取8gNaOH固体溶于蒸馏水并定溶至100ml。
2.4 实验步骤
2.4.1转接活化斜面：
将菌种TG866转接划满活化斜面，32℃培养20h。
2.4.2种子培养：
向已灭菌的种子培养基加入尿素（1.2ml/瓶），用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至Ph7.0～7.2。按1ml生理盐水/1支大试管斜面的用量，将活化斜面上菌种洗下，混匀。按3%的接种量（1ml）接入种子培养基，9层纱布封口，240rpm，32℃摇瓶培养7～8h使菌体长至对数生长中后期。 2.4.3测定OD620值：
0h测一次，7h测一次，若OD值净增0.5以上（一般达到0.7以上比较好）则放入冰箱保存待用。接入发酵培养基时从两瓶中选用一瓶。 2.4.4摇瓶补料发酵：
向已灭菌的发酵培养基加入尿素，（1.2ml/瓶），用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至Ph7.2～7.5，将种子培养基按10%的接种量（3ml）将种子液接入发酵培养基中，9层纱布封口，240rpm，32℃摇瓶发酵约30h。测定0h的OD620值。 2.4.5
在无菌台取样0.5ml至离心管中，残液测定pH值，酌情加入尿素0.2～0.6ml补料，使pH值维持在7.2～
7.5，酌情加入50%的葡萄糖溶液补料（加入量约0.5～1.2ml，视具体情况而定），使残液维持在20～30g/L，测定OD620值和残糖量，每隔3h做一次连续进行至晚上10点，酌情补料。 2.4.6
每隔3h做一次连续进行至40h。 2.5 测定方法
2.5.1菌种生长情况
吸取0.5ml发酵液于1.5ml离心管中，8000r/min离心3min，上清液用于测量残糖量和谷氨酸产量，沉淀稀释100倍，用722光栅分光光度计在620nm波长下测其OD值，菌种OD值可以反映菌体的浓度，通过菌体浓度可知菌体生长情况。 2.5.2残糖量和谷氨酸量的测定
上（1）中的上清液稀释100倍（取0.1ml稀释至10ml），用生物传感分析仪测定残糖量和谷氨酸量。2.5.3 pH值的测定
用pH6.4～8.0的pH精密试纸测定pH值。
实验结果和分析
3.1 四个梯度的发酵液中OD值变化
时间/h 0 3 6 9 12 24 27 葡萄糖100 加葡萄糖100 加葡萄糖70 加葡萄糖70 加酵母膏① 酵母膏② 酵母膏① 玉米浆② 0.831 0.802 1.205 0.894 0.926 0.89 1.277 0.858 1.01 0.96 1.366 0.849 1.054 0.971 1.415 0.95 0.995 1.01 1.4 0.946 1.203 1.22 1.474 1.082 1.459 1.06 1.208 1.21 OD值变化曲线1.61.51.41.31.21.11.00.90.80.70.60.5036912151821242730时间/hOD值（620nm波长处）葡萄糖100 加酵母膏①葡萄糖100 加酵母膏②葡萄糖70 加酵母膏①葡萄糖70 加玉米浆②
图3-1 4个梯度的发酵液中OD值随时间变化曲线图 3.2 葡萄糖70 加酵母膏①梯度发酵液中OD值、残糖量及谷氨酸产量变化