硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定
摘要 本实验以小麦为实验材料，对小麦进行预处理，提取酶液进行硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定，说明小麦对氮素的利用途径。 关键词 小麦 硝酸还原酶 谷氨酰胺合成酶 酶活性
引言
硝酸还原酶(NR)是植物代谢中十分重要的一种酶,它主要是在硝酸亚硝化过程中起催化作用。同时, 它对其他代谢如光合作用、碳代谢和能量代谢都有重要影响[1]。就植物的生长和发育而言 ,氮素的同化是个十分重要的生理过程。 其中 ,无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能被植物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶 (GS) 是高等植物氮代谢中十分重要的酶 ,它和谷氨酸合成酶联合作用 ,催化氨的同化 ,使其转变成 Gln 和 Glu ,在小麦植物体内含氮有机物的生物合成中作为 N 的供体[2]。
1、实验材料与方法
1.1实验材料与试剂
小麦、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝酸钾、三氯乙酸、反应液、终止液、显色液、亚硝态氮标准溶液、三羟甲基氨基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二醇双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）。 1.2实验原理
1.2.1硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-
萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。此红色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。故硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可有标准曲线查的。 1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它能催化植物体内在硝酸还原过程中产生的氨与谷氨酸形成谷氨酰胺，实现氨的同化，在生物体内，谷氨酰胺既是氨的贮存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，在进一步合成其他氨基酸。但在该实验设计反应体系中，谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。 因此，谷氨酰胺合成酶的活性可用产生的γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物的量来表示，一般间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位为：A?mg-3(protein) ?h-1。
1.3实验步骤
1.3.1硝酸还原酶活性的测定 1.3.1.1标准曲线制作
取7支试管，按下表顺序依次添加试剂。摇匀后在30℃下水浴20min，然
后在540nm下比色。以亚硝态氮含量与对应吸光值建立回归方程。 符 号 1 2 3 4 5 6 7 亚硝酸钠标准液 蒸馏水 试剂 （ml） 1% 磷胺 0.02%α-萘胺 酶管含亚硝态氮（ug） 1.3.1.2硝酸还原酶活性测定
植株预处理、取样、酶活性反应：先往对照瓶中加入1ml终止液，然后往3个瓶中均加入9ml反应液；混匀后立即放入真空干燥箱中，抽真空15min（期间停顿几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底）；之后将各瓶在30℃、黑暗条件下静置反应30min；反应时间到，立即往两个测定瓶中加入1ml终止液；将各瓶摇匀，再静置3min。最后进行显色反应，根据标线求得亚硝态氮含量。计算硝酸还原酶活性。 1.3.2谷氨酰胺合成酶活性的测定 1.3.2.1酶液的提取
称取植物叶片1.0g，置于预冷研钵中，加3ml酶液提取液，置冰浴上研成匀浆，转移于寓心管中，在4℃下、15.000转离子20min，上清液即为酶液。 1.3.2.2谷氨酰胺合成酶活性测定
取3支试管，分别加入0.7ml酶液和0.7mlATP溶液：然后往其中1支加入1.6ml反应混合液A（作为对照管），另外2支各加入1.6ml反应混合液B（作为反应管），混匀后，将3支试管均置于37℃水浴下反应30min；反应结束
0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0