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高致病性H7亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法
1 范围
本方法规定了检测H7亚型动物流感病毒核酸的TaqMan荧光RT-PCR操作程序。 本方法适用于高致病性H7亚型动物流感病毒核酸的快速检测和定型。 2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法。 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫。 GB 19489 实验室生物安全通用要求。
GB/T18936-003 高致病性禽流感诊断技术。
GB/T 19438.1 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语
荧光RT-PCR 实时荧光反转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR） HA 血凝素（Hemagglutinin）
FAM 羧基荧光素（Carboxyfluorescein ） DEPC 焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate）
Ct/Cp值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数 （Threshold Cycle /Crossing Point） 4 原理
2013年3月底我国发生人感染H7N9流感病毒的公共卫生事件，这也是世界上首次发现H7N9亚型流感病毒能够感染人。本方法结合H7N9变异情况，在对序列比对的基础上，设计一对引物和一条FAM荧光素标记的探针，建立了能够检测高致病性H7亚型流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。 5 试剂和材料
5.1 试剂
5.1.1 总则：除另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。 5.1.2 DEPC水：见附录A.1。 5.1.3 无水乙醇。
5.1.4 PBS（含青霉素和链霉素）：配方见附录A.2。
5.1.5 H7亚型流感病毒荧光RT-PCR检测引物、探针序列、反应液配方见附录B。 5.1.6 阴性、阳性对照
——阴性对照为SPF鸡胚尿囊液。
——阳性对照为β-丙内酯灭活（4℃灭活72 h）的高致病性H7N9亚型流感病毒胚尿囊液培养物。
5.1.7 Carrier RNA工作液的准备
裂解液在使用前需要按比例添加Carrier RNA，配制好后在2~8℃保存最多48h，（因此裂解液必须
现用现配）。配制方法见下表。
Carrier RNA工作液配制表 样品个数（份） 裂解液（mL） Carrier RNA（μL） 样品个数（份） 裂解液（mL） Carrier RNA（μL） 1 0.21 5.9 6 1.26 35.4 2 0.42 11.8 7 1.47 41.3 3 0.63 17.7 8 1.68 47.2 4 0.84 23.6 9 1.89 53.1 5 1.05 29.5 10 2.10 59.0 注意：请将裂解液与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液；为避免溶液出现气泡，请勿使用漩涡震荡。Carrier RNA的使用对于有效回收两种病毒核酸是重要的。首先，Carrier RNA促进病毒核酸与二氧化硅膜的结合，特别是当样品中仅存在少量病毒核酸分子时；另外，当存在少量活性RNA酶分子的情况下，Carrier RNA能降低病毒RNA被降解的可能性。如果不向裂解溶液中加入载体RNA，可能导致病毒核酸收集量下降。 5.1.8 向缓冲液GD中加入无水乙醇。 5.2 仪器设备
5.2.1 荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。
5.2.2 高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12 000 r/min）。 5.2.3 台式离心机。 5.2.4 振荡器。 5.2.5 组织匀浆器。
5.2.6 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种）。
5.2.7 微量移液器（5 ?L，10 ?L，100 ?L，1 000 ?L）及配套吸头。 5.2.8 1.5 mL 离心管（无核酸酶）和5 mL采样管。。 6 样品的采集与前处理
6.1 总则
尽量使用新鲜的样品材料。采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套，注意无菌操作。 6.2 取样工具
6.2.1 采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、商品化一次性采样袋。 6.2.2 除采样袋外，上述取样工具必须经121℃±2 ℃，15 min高压灭菌并烘干或经160 ℃干烤2 h。 6.3 样品采集 6.3.1 拭子样品
根据动物种类可分别采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽类）或鼻拭子（猪）。采集方法如下： ——取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液； ——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； ——取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物；
将采样后的拭子分别放入盛有1.0 mL PBS（含青霉素和链霉素）的采样管中，编号。 6.3.2 肌肉或脏器样品
用无菌剪、镊采集待检脏器或肌肉组织，装入无菌采样袋或其它灭菌容器，编号。 6.4 样品贮运
样品采集后置保温箱中，加入预冷的冰袋，密封，24 h内送实验室。 6.5 样品处理 6.5.1 拭子样品
样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3 000 r/min离心5 min，吸取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。
6.5.2 肌肉或脏器组织
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS（含青霉素和链霉素）混匀，3 000 r/min离心5 min后，取1.0 mL上清液转入无菌1.5 mL灭菌离心管中，编号备用。 6.6 样品存放
采集或处理好的样品在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。 7 荧光RT-PCR检测操作方法
7.1 实验室的标准化设置与生物安全管理 实验室设置与管理见GB/T 19438.1附录C。 7.2 样本核酸的提取
7.2.1 在样本制备区进行，采取柱式提取。也可采用经验证的其他商品化RNA提取试剂盒。
7.2.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。 7.2.3 用移液器将20μL蛋白酶K加入n个灭菌1.5mL离心管中。
7.2.4 向离心管中加入200μL待处理样品（包括阳性对照、阴性对照），如果样品体积小于200μL，可加入PBS补齐。
7.2.5 加入200μL Carrier RNA工作液（裂解液与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法如表1，或按照公式计算）。盖上管盖，漩涡振荡15s。 7.2.6 在56℃孵育15min。瞬时离心。
7.2.7 加入250μL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并漩涡振荡15s，在室温放置5min，瞬时离心。
7.2.8 仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至吸附柱，6000g（8000 rpm）离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
7.2.9 打开吸附柱盖，加入500μL缓冲液GD（请务必确认该试剂在用前加入无水乙醇），盖上吸附柱管盖，6000g（8000rpm）离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。 7.2.10 重复步骤7.2.9一次。
7.2.11 13400g（12000rpm）离心3min，使吸附柱的膜变干，弃废液。
7.2.12 将吸附柱放入一个干净的1.5mL RNase-Free离心管，打开吸附柱盖，向吸附柱的膜中央加入20μL DEPC水，盖上吸附柱的盖，室温放置1min。13400g（12000rpm）离心1min，洗脱RNA待用。 7.2.13 提取的RNA尽快进行扩增，短期保存可在4 ℃冰箱，若需长期保存须放置-70 ℃冰箱。 7.3 荧光RT-PCR扩增试剂的准备与配制 在反应混合物配制区进行。
每个检测反应体系需使用15μL荧光RT-PCR反应液。根据7.2.2中提到的n值，按附录B.2配制反应液，充分混匀后分装，每个反应管15 μL。转移反应管至样本制备区。 7.4 加样
在样本制备区进行。
在上述7.3的反应管中分别加入7.2.12中制备的RNA溶液5 μL，使每管总体积达到20 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，500 r/min离心30 s。 7.5 荧光RT-PCR反应 在检测区进行。
应使用能采集并区分FAM荧光信号的荧光PCR仪。
将7.4中加样后的反应管放入荧光PCR检测仪内，编辑样品表后，选定FAM检测通道读取H7亚型流感病毒检测结果，淬灭基团选择none。之后如下设置反应参数：
—— 第一阶段，反转录45 ℃/15 min； —— 第二阶段，预变性95 ℃/2 min；