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倒地铃乙酸乙酯提取物体外抗氧化活性研究
作者：梁华益 吴开慧 冯霞 来源：《湖北农业科学》2017年第19期
摘要：为研究倒地铃（Cardiospermum halicacabum）乙酸乙酯提取物的体外抗氧化作用，用乙酸乙酯加热回流提取倒地铃中的有效成分，采用紫外分光光度计法，测定其消除DPPH自由基能力，并以丁基羟基茴香醚（BHA）作为参照测定螯合Fe2+能力以及还原Fe3+能力。结果表明，倒地铃乙酸乙酯的提取物对DPPH自由基有较强的清除能力，对Fe2+的螯合能力及还原Fe3+的能力也较强，说明倒地铃乙酸乙酯提取物的抗氧化性较强。
关键词：倒地铃（Cardiospermum halicacabum）；乙酸乙酯；抗氧化；自由基 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）19-3720-03 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.031
Abstract： To study the antioxidant effects of ethyl acetate extract from Cardiospermum halicacabum，refluxing the Cardiospermum halicacabum with ethyl acetate to extract the active components. The UV spectrophotometry was applied to determine the ability of eliminating DPPH radicals，chelating Fe2+ in comparing with butyl hydroxy anisole（BHA） and reducing Fe3+ to evaluate its antioxidant activity. Results showed that，the ethyl acetate extract of Cardiospermum halicacabum had strong ability to clear DPPH free radicals，the ability of chelating Fe2+ and the reduction of Fe3+ were also strong，showing the ethyl acetate extract from Cardiospermum halicacabum have strong antioxidant capacity.
Key words： Cardiospermum halicacabum；ethyl acetate extract；antioxidant
倒地铃（Cardiospermum halicacabum）是无患子科植物，干燥全草，味苦、寒，具有清热解毒、凉血、消肿之效，常用来治疗百日咳、咽喉炎、糖尿病、疔疮、湿疹等。相关研究表明，倒地铃主要含有：十五烷酸、蒲公英赛醇、芹菜素、棕榈酸、原儿茶酸、β-谷甾醇、原儿茶醛、正二十七烷、β-香树脂醇、芦丁、毛蕊异黄酮、槲皮素、β-香树脂醇棕榈酸酯、豆甾醇、β-胡萝卜苷、金圣草黄素、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、3β-赤杨醇等成分[1]。倒地铃中有黄酮、萜类、甾醇和有机酸等多种化学成分。黄酮类化合物具有抗氧化及抗自由基、抗肿瘤、抗人类免疫缺陷病毒、抗炎及抗免疫、抗心血管疾病、雌激素样与抗雌激素样等功能[2]。目前，国内外主要对倒地铃的研究在成分和药理方面上，但体外抗氧化方面研究较少，对倒地铃的乙酸乙酯提取物体外抗氧化研究更少。因此，本试验对倒地铃的乙酸乙酯提取物进行研究，为倒地铃的开发利用提供依据。 1 材料与方法
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1.1 材料
倒地铃，购于广西百色市。 1.2 试剂
乙酸乙酯、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过氧化氢、硫酸亚铁、1，1-二苯基-2-三硝基苦肼（DPPH）（美国Sigma公司）、丁基羟基茴香醚（BHA）（上海晶纯试剂有限公司，批号：20452）、菲洛嗪等，均为AR。 1.3 仪器与设备
电子天平（GN2085型，上海民桥精密科学有限公司）；台式离心机（TDL80-2B型，上海安亭科学仪器厂）；回流装置；水浴锅（HH-S型，巩义市英峪予华仪器厂）；电热恒温旋风干燥箱（DHG-9O70OA型，上海精密设备有限公司）；旋转蒸发仪（RE-300型，上海阿荣生化仪器厂）；紫外可见分光光度仪（755B型，上海精密仪器公司）。 1.4 方法
1.4.1 倒地铃乙酸乙酯提取物的提取 精确称取粉碎过的倒地铃粉末50.000 g，放入500 mL乙酸乙酯中浸泡1 h，加热回流提取2 h，抽取滤液后放入旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，烘干制成浸膏，称量，用乙酸乙酯溶解制备成所需浓度的倒地铃样品提取液，备用。
1.4.2 清除DPPH自由基能力 DPPH是一种稳定的自由基，与抗氧化剂发生反应，提供H被还原，颜色由深紫色变为淡黄色，可用紫外可见分光度法定量测定，以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度样品对自由基的清除率，以自由基清除率为50%时样品的浓度（IC50）来衡量样品对自由基的清除能力，IC50越小，表明样品清除自由基的能力越强[3]。
取5只5 mL具塞比色管，加入0.5 mL新配置的6×10-4 mol/L DPPH溶液，然后加入1 mL浓度分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的样品溶液用无水乙醇定容至5 mL，室温暗光下反应30 min，以无水乙醇调零，在517 nm波长处测定吸光度A。 清除率=[（A1-A2）/A1]×100%
式中，A1为开始反应时空白吸光度，A2为反应30 min时的吸光度。
1.4.3 对Fe2+螯合能力试验 参照文献[4]，于10支5 mL具塞比色管中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL浓度为0.2 mg/mL样品溶液及标准品BHA溶液，再加入0.2 mol/L FeSO4 0.1 mL溶液混匀，加入5 mol/L菲啰嗪0.2 mL，无水乙醇定容到5 mL充分振荡，室温下放置10 min。以无水乙醇调零，562 nm处测定吸光度（进行3次平行测定），吸光度越低表示金属螯合能力越强。
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螯合率=[（A0-A1）/A0]×100%
式中，A0为不加样品时的吸光度，A1为加入样品时的吸光度。
1.4.4 还原Fe3+能力试验 采用普鲁士兰法，测定样品还原Fe3+能力，在5只5 mL具塞比色管中依次加入浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的样品溶液2.5 mL，0.2 mol/L pH为6.6 2.5 mL磷酸盐缓冲液和2.5 mL铁氰化钾（1%），混匀后置于50 ℃水浴中反应20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（10%），混匀后将溶液离心（3 000 r/m）10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL（0.1%）三氯化铁溶液，混匀，以试剂空白作参比，在700 nm处测定吸光度，吸光度增加表明还原能力增强[5]。 2 结果与分析
2.1 清除DPPH自由基能力
倒地铃乙酸乙酯提取物对DPPH自由基清除能力结果见图1。从图1可知，倒地铃乙酸乙酯提取物对DPPH自由基有较强的清除作用，且随着浓度的增加而增强，呈一定的量效关系。当倒地铃提取物的浓度为0.628 177 mg/mL时倒地铃对DPPH自由基的清除率为50%，说明倒地铃乙酸乙酯提取物对DPPH自由基清除能力较强。 2.2 对Fe2+螯合能力
倒地铃乙酸乙酯提取物对Fe2+螯合能力见图2。从图2可知，倒地铃乙酸乙酯提取物和标准品BHA对Fe2+都具有较强的螯合能力，但螯合率与样品浓度增加不成量效关系，且与BHA相比倒地铃螯合Fe2+能力较弱。 2.3 还原Fe3+能力
倒地铃乙酸乙酯提取物对Fe3+还原能力见图3。从图3可知，随着浓度的增加，吸光度增加，说明还原Fe3+能力也随着增强，还原Fe3+能力随浓度的增加呈量效关系，证明倒地铃具有一定的抗氧化作用。 3 讨论
天然产物成为现代重要的抗氧化剂，具有低毒、高效的清除人体多余的自由基，能预防衰老以及治疗自由基引发的相关疾病，对保护人类的身体健康起着重要的保障作用，所以从天然产物中探索新的清除人体自由基的抗氧化剂成为医药、保健事业发展的趋势[6]。天然植物是体外抗氧化物质的重要资源，其提取物的抗氧化作用研究受到人们关注。不同天然植物提取成分的性质及抗氧化机制不同，其抗氧化机制主要有直接清除或抑制自由基，提供质子、电子，作用于与自由基有关的酶，抑制氧化酶的活性[7]。自由基是人体在新陈代谢中不断产生的，具有极强的的氧化能力，如果积累过多，可以通过一系列氧化反应破坏细胞的结构与功能，从