一个新的水稻幼苗黄叶突变体的遗传分析及其基因的初步定位

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一个新的水稻幼苗黄叶突变体的遗传分析及其基因的初步定位

作者：葛绍兴等

来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2013年第01期

摘要： 在60Coγ射线辐照的水稻突变体库中，发现了一个以粳稻品种日本晴为遗传背景的幼苗叶色黄化突变体syl11（seedling yellow leaf 11）.与野生型相比，突变体幼苗第二和第三叶表现黄色，在其完全展开之前叶片自其顶端开始转绿，长到四叶期其叶色恢复正常；并且该突变体syl11幼苗黄色叶片光合色素含量明显下降.遗传分析表明，该突变体的遗传性状由1对隐性核基因控制.本研究以培矮64S/syl11的F2代突变型植株作为定位群体，应用微卫星（SSR）分子标记以及新发展的InDel分子标记，将基因syl11定位在水稻第11号染色体长臂上的RM26652和处于着丝粒附近的ID11974分子标记之间，其遗传距离分别为0.5 cM和0.7 cM.

关键词： 水稻； 光合色素； 叶色突变体； 基因定位

中图分类号： Q 344文献标识码： A文章编号： 1000-5137（2013）01-0049-06 0引言

绿色植物的光合作用被称为地球上最重要的化学反应.据统计，水稻植株中90%～95%的碳水物质来自叶片光合作用的产物，植物光合作用对光能的利用是从光合色素对光能的捕获开始的.一般来说，正常的水稻绿色叶片中叶绿素a和叶绿素b的比例约为3∶1[1]，而当叶绿素含量比例失调时，水稻叶片就表现出不正常的叶色，从而影响其光合作用.

水稻叶色突变体研究日渐成为水稻功能基因组学的重要研究内容之一.目前，除了天然自发突变外，还可以通过适当的核辐射诱变[2-3]、化学诱变剂处理[4-5]、T-DNA插入突变[6]、转座子（Ac/Ds系统）插入突变[7]以及逆转座子（逆转录转座子Tosl7）插入突变[8]等方法获得水稻叶色突变体.水稻叶色突变体的主要特点是突变体苗期叶色表型发生变异，表现为白化、黄化、浅绿、绿白、白翠、黄绿、绿黄、和条纹等不同类型[9]，并可致使控制叶绿素生物合成和叶绿体发育的关键基因沉默或失活，直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量[10-15].大量研究结果显示，水稻叶色突变体不仅可以应用于作物育种、植物光合作用、遗传转化、基因调控等基础研究中，而且其还是研究叶绿素生物合成途径、叶绿体的结构功能和遗传发育调控机制的理想材料[16-17].因此，发掘和鉴定新的控制植物叶色突变的基因，并开展新的突变基因的定位、克隆及其作用机理等方面的研究，不仅具有重要的理论意义，更具有实际的应用价值.

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关于水稻叶色突变性状的遗传，国内外的学者进行了大量的相关研究，除了李贤勇等[18]报道的由1对显性单基因控制的深绿色水稻突变体和钱前等[19]在秀水11/春江03F4株系中发现的细胞质遗传的白绿苗突变体之外，多数水稻叶色突变体都是受一对隐性核基因控制的.目前，除了第12号染色体，已经报道了近80个水稻叶色突变基因[20-21].本研究不仅对水稻幼苗黄叶突变体syl11的不同时期叶色表型、形态特征等进行了观察和分析，还对其突变基因进行了遗传分析，并利用SSR及InDel分子标记对该突变基因进行了初步定位，以期为该基因的分子克隆及其作用机理的研究奠定基础. 1材料与方法 1.1材料

水稻幼苗黄叶突变体syl11是从日本晴经60Coγ射线诱变处理的M2代群体后代中筛选获得的.突变体syl11经多次自交繁殖和选择，其突变性状和各种农艺性状均已稳定. 1.2方法

1.2.1突变体的表型观察

为了进一步确定突变体syl11幼苗叶色黄化的突变性状，将突变体syl11及其野生型日本晴的种子在32 ℃条件下催芽4 d后，播种在装有水稻土的塑料盆内，放置在32 ℃的光照培养箱（GXZ智能型，宁波，江南仪器厂）内，每天光照12 h（光照强度为180 μmol·m-2·s-1）进行培养，观察突变体syl11及其野生型日本晴苗期叶色变化，并对其进行拍照. 1.2.2叶片光合色素含量的测定

待幼苗黄叶突变体syl11与野生型日本晴长至二、三、四叶期时，参照沈伟其[22]描述的水稻叶片叶绿素浸提法，分别提取syl11第二叶、第三叶以及四叶期的第3叶的光合色素，然后使用BECKMANCOULTER-DU720分光光度计分别测定470，645，663 nm 3个波长下的吸光值，分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，实验均重复3次. 1.2.3遗传分析以及定位群体的构建

2010年夏，在上海以突变体syl11和培矮64S杂交配组获得的F1代种子，同年冬季在海南省陵水县浙江省农科院南繁基地实验田加代种植，获得F2代种子.取适量F2代种子在32 ℃条件下，催芽5 d之后，播种在带有少量湿润水稻土的托盘内，并用保鲜膜密封.然后将其放置于32 ℃光照培养箱（GXZ智能型，宁波江南仪器厂）内进行培养，并保持光照强度为180 μmol·m-2·s-1，每天光照12 h.待约一周之后，开始观察幼苗叶色表型分离情况，并进行遗传分析.与此同时，将从突变体培矮64S/syl11F2群体中挑出的具有突变表型的幼苗，仍然放置在原光照培养箱内继续生长，待长至四叶期后，进行DNA的提取及基因定位.

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1.2.4水稻DNA的提取

采用改良后的CTAB法[23]，提取亲本以及F2代遗传群体基因组DNA. 1.2.5突变体syl11的基因定位

本研究首先选取82对GRAMENE网站（http：//www.gramene.org/）上公布的以及本实验室开发保存的SSR及InDel的分子标记检测突变体syl11和培矮64S的多态性，然后选取均匀分布在水稻12条染色体上的有多态性的引物，对22株突变表型F2遗传群体进行连锁分析，初步确定突变基因在染色体上的位置.接着进一步扩大F2群体进行遗传定位，并在目标区域内根据NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上公布的日本晴和9311的全基因组序列差异寻找InDel位点，然后在此基础上使用Primer Premier 5.0软件设计引物.引物由上海生工生物工程技术服务公司合成.25 μL的PCR反应体系包括：100 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、80 mmol/L（NH4）2SO4、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/mL Taq酶和20 ng模板DNA.在Eppendorf 和东胜PCR仪上进行扩增，PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s（退火温度随不同引物变化），72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min.反应产物用2.5%～3.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，而对于多态性不明显的引物的PCR产物，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染之后用冷光源胶片观察灯观察，并拍照记录. 1.2.6连锁分析

本研究将F2遗传群体中与syl11突变体DNA带型一致的单株记作A，与培矮64S带型一致的单株记作B，而与F1带型一致的单株记作H，缺失的单株记作-，应用MAPMAKER/EXP3.0[24]作图软件，构建目的基因区域的分子标记连锁遗传图谱. 2结果与分析

2.1突变体syl11的表型及光合色素含量分析 3讨论

叶色突变体是比较常见的一类水稻突变体，其表型丰富，有如叶片上只有白化、黄化（包括黄绿和淡绿）、紫叶和暗绿叶等1种颜色的单色突变，也有如叶片为条斑叶、斑马叶、斑点叶等含有2种或2种以上颜色的杂色突变.这些丰富的突变体为揭示水稻叶色变化的分子机制提供了有用材料.

伴随水稻全基因组测序的完成，到目前为止，在水稻第1～11号染色体上均有水稻叶色突变基因的报道，其中6个相关基因被克隆[20-21].与本研究突变体syl11位于同一条的第11号染色体的水稻叶色突变体共有9个，其中包括2个为“斑马叶”z1、z2[25]的杂色突变，5个为白化突变体sgra[26]、tsc-11[27]、gwgl[28]、v4[29]、v9[30]以及2个为黄叶突变体xnt[31]、