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厚朴多酚的提取及体内抗氧化研究
作者：丁浩东 夏卫生 曾军英 来源：《湖南农业科学》2018年第03期
摘要：抗氧化活性是研究动物抗衰老的重要方面。以厚朴树皮为原料，比较超声波法和浸提法提取厚朴多酚的含量差异，并研究了厚朴多酚对KM小鼠体内抗氧化活性和有害性。结果表明：采用超声波提取法提取得到的多酚纯度为76.67%，高于浸提法（64.11%）；厚朴多酚进行分组对比试验，灌胃饲养试验表明：KM小鼠血清中抑制羟自由基的能力和抗氧化成分（T-SOD、CAT、GSH-Px）的活性都得到提升，而有害的成分丙二醛MDA的含量有所降低。因此，厚朴多酚有抗氧化作用，有可能使动物健康生活，从而达到抗衰老的效果。 关键词：厚朴多酚；KM小鼠；灌胃；血清；活性
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2018）03-0029-04
厚朴（Magnolia officinalis）为我国著名的中药，具有燥湿消痰、下气除满的功效，用于湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。厚朴树皮具有化湿导滞、下气除满、化食消痰、驱风镇痛等功效；种子有明日益气之功效，芽可作妇科药用，还可以加入癌症药物中。目前，藿香正气丸、开郁顺气丸、香砂养胃丸、润通口服液等常用药中均含有厚朴，其主要有效成分为厚朴酚与和厚朴酚。
厚朴树皮中主要含有木脂素类化合物、挥发油、生物碱等成分。木脂素类化合物是厚朴中分离出的最主要化学成分，迄今为止，已分离出20多种，多数属于新木脂素，主要有厚朴酚与和厚朴酚。厚朴中大约含有1%的挥发油，其中大部分都具有镇静作用，据研究，将提取的厚朴挥发油进行GC-MS研究，分离出了48种成分，按叶油醇及其异构体是主要成分，约占挥发油总量的40%～55%。挥发油普遍存在于树皮、根皮、树叶和花中，但是花与其他部位的挥发油的组分有较大的区别。厚朴树皮中生物碱含量较高，王洪燕等对凹叶厚朴中生物碱的化学成分进行研究，得到9个异喹啉生物碱。除此之外，有学者从厚朴树皮材料中分离出了槲皮苷、芦丁、花生酸、棕榈酮、二十六烷醇、β-谷甾醇、胡萝卜苷。
自由基是人体生命活动中多种生化反应产生的正常代谢产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与被清除的动态平衡中，自由基是机体有效的防御系统，对维持机体正常代谢有一定促进作用。但是自由基产生地过多或者清除地过慢，就会对人体细胞膜及大分子（如蛋白质、DNA）产生一系列损害，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。因此，一些化学合成的抗氧化剂被广泛用于食品和医药领域。但最近研究表明合成的氧化剂具有各种缺陷，例如BHT、BHA，由于它们会对人体器官造成伤害而遭到禁用。因此，寻找天然高效和低毒性抗氧化剂日益受到关注。而厚朴是我国传统的中草药，在全国制药行业中利用厚朴配方的中成药多达200余种。近年来，一些研究已发现厚朴酚可以保护小肠、脑和后肢的缺血和再灌注损伤。深入研究厚朴多酚的抗氧化作用，可以为进一步研究和开发利用厚朴提供参考。
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1材料与方法 1.1试验材料
KM小鼠，厚朴树皮从湖南采购。主要器材：CTXNW-10B超声循环提取机（北京弘祥隆生物技术开发有限公司），功率200w；SHZ-3循环水多用真空泵；药物粉碎机；旋转蒸发仪。主要试剂：没食子酸；DPPH；ABTS；所用的试剂盒均从南京建成生物工程研究所购买，常用试剂均为AR级。 1.2试验方法
1.2.1厚朴类化合物的提取（1）超声波提取法。将烘干后的树皮打碎成厚朴粉，过60目筛。参照李胜华对多穗柯总黄酮的提取工艺设计，称取4 kg的厚朴粉加10倍量的80%乙醇浸泡24 h，超声循环提取50 min，过滤得到粗多酚液，再减压浓缩成浆状，即可获得粗提取液。（2）浸提法。该法由于工艺简便、成本低、纯度高而被广泛使用，但此法提取率低。称取250 g厚朴粉，加10倍量的80%乙醇浸泡。每次搅拌相隔约为8 h，每天搅拌3次，浸泡3 d。过滤得到粗多酚液，再减压浓缩成浆状，即可获得粗提取液。
1.2.2厚朴多酚类化合物的纯化 D-101型大孔树脂先进行预处理，之后装入层析柱，调节好流量1.0 mg/mL。将粗提取液倒入层析柱中，再依次用4L60%和30%的乙醇导入层析柱中进行纯化。将纯化得到的溶液倒入瓷盘中，放入65%烘箱中烘干，再用研钵研碎，即可得到厚朴多酚粉。将粉末放入4℃冰箱中备用。
1.2.3厚朴多酚粉的多酚含量测定 精确称取0.100 g没食子酸标准样品。蒸馏水溶解并定容至1 000 mL。该标准液浓度为0.1 mg/mL。准确量取上述标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于50mL容量瓶中，各加30mL水，摇匀，再加2.5mLFC试剂，充分摇匀。1 min之后，加入碳酸钠溶液（20%）7.5 mL，混匀定容。水浴75℃下反应10min。于760nm波长下比色，测定吸光度，建立标准曲线，得到回归方程（多酚含量以没食子酸等价物表示）。 1.2.4厚朴多酚粉的多酚含量测定 准确称取50mg厚朴多酚粉末于50 mL容量瓶中，配成母液，采用梯度稀释制得100倍稀释液和200倍稀释液，移取1mL稀释液进行测定。用紫外可见分光光度计测得吸光值，将其代入标准曲线回归方程中，获得样品多酚浓度，再按公式（1）计算出多酚的含量。
多酚含量=（样品浓度×样品稀释倍数）/取样量×100% （1）
1.2.5厚朴多酚抗氧化活性试验 （1）KM小鼠选择。试验所用小鼠为体重在30±3g的KM小鼠50只，雌雄各25只，然后进行随机分组。分5组，每组5只雄、5只雌，雌雄分开，用苦味酸分别标记左上肢，右上肢，左下肢，右下肢，背部。（2）灌胃试验。配制20mg/mL的厚朴多酚溶液，灌胃分高剂量组（400mg/kg）、中剂量组（200mg/kg）、低剂量组
（100mg/kg）灌胃配制的厚朴多酚溶液，VC对照组用维生素C100 mg/kg剂量灌胃，空白对照
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组用水100mg/kg剂量灌胃。维生素每次灌胃前半小时配制。每两天称重1次。灌胃两周，然后停止灌胃，休整1d之后取血处死。（3）取样及处理。处死前提前先配制抗凝血剂，实验用的抗凝血剂是柠檬酸钠。试验过程：摘眼珠取血保存并标记。小鼠取血滴加抗凝剂按7：1滴加，当天离心分离血浆，离心用4000 r/min，离心时间6min，标记好置于4℃冰箱临时保存待用.
1.2.6指标测定 用考马斯亮兰测定蛋白；硫代巴比妥酸法测定MDA含量；黄嚓吟氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；DNTB直接比色法测定谷光甘肤过氧化物酶（GSH-px）的活性；可见光比色法测定过氧化氢酶（CAT）的活性。测定试验全部参照试剂盒的使用说明进行。
1.2.7数据处理 通过SPSS19.0软件系统计算均值、标准差，动物试验部分的相应数据用x±s表示，并用配对t检验和两样本均数比较t检验检测其显著性。 2结果与分析
2.1厚朴多酚粉的多酚含量测定
以没食子酸溶液的浓度为横坐标，没食子酸不同浓度的溶液所对应的吸光值为纵坐标绘制没食子酸标准曲线（图1），得到没食子酸标准曲线回归方程为：y=89.179x-0.000 8，R2=0.9994，其中x：没食子酸等价物质量浓度（mg/mL）；y：溶液在510mm处吸光值。厚朴多酚粉的吸光值及多酚含量如表1所示。
由表1可知，两种方法提取厚朴多酚得到的纯化物的含量均较高，超声波提取法（76.67%）明显优于浸提法（64.11%）。因此，试验选取用超声波提取法得到的纯化物作为体内抗氧化的试验材料。 2.2血清中蛋白含量测定
由表2可知，不同灌胃组之间的蛋白含量均达到了85 g/L，各组间蛋白含量没有显著差异（P>0.05），说明厚朴多酚对于小鼠血浆中的蛋白含量没有显著影响。 2.3抑制羟自由基能力的测定
用生理盐水将血清（浆）按1：1、1：4、1：9、1：19、1：49、1：99等稀释成一系列不同浓度的血浆，分别取不同浓度的血浆0.2 mL按血清的测定操作表进行检测。
根据表3的试验结果，并结合试剂盒要求抑制率在45%～55%效果最为理想，此次的试验稀释20倍时的抑制率在47.14%，符合要求，因此羟自由基测定试验采用20倍稀释液进行。经过预试验，确定好了血浆样品稀释倍数，经稀释后，采用上述相同方法进行试验，羟自由基测定的结果见表4。