蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）
WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A第一部分：蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：
1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提
取方法或选择不同的试剂盒产品）；
2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂
等的选择）；
3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋
白酶和磷酸酶抑制剂）；
4. 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策
略）；
5. 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
方法的选择
? 自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取 ； ? 购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取 。
Example 1：
实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：
1. 提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）； 2. 配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需
的量，临用临配）；
3. 裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分
裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。
4. 蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。
注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。
5. 样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。
具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。 6. 分装并存于-80℃，避免反复冻融。
B 第二部分：
相关试剂的配制：
1. 10%的SDS（戴口罩称取）：
称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在50℃水浴溶化后，仍可使用。 2. 1.5M Tris/HCL（pH8.8）
Trisbase 18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，室温下保存。
3. 0.5M Tris/HCL（pH6.8）
Trisbase 6.06g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至6.8，最后定容至100ml，室温下保存。
4. 30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亚甲丙烯酰胺 丙烯酰胺（Acr） 75g 甲叉双丙烯酰胺
2g
加双蒸水150ml，37℃加热溶解后，定容至250ml，查证该溶液pH应不大于7.0，4℃棕色瓶保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
Be careful!!!：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 5. 上样缓冲液 0.5mM Trisbase(pH6.8)
甘油 10％SDS
2.5ml 2.0ml 4.0ml
0.4%溴酚蓝（mw669.97） 1ml 二巯基乙醇（mw78.14） 0.5ml 注：配好后分装-20℃保存。 6. 电泳缓冲液
Trisbase 甘氨酸 SDS
10倍储存液
30g 144g 10g
1倍应用液
3g 14.4g 1g
加水至1000ml，PH值用HCl调8.3。已经配制了1000ml的储存液。电泳缓冲