生物技术专业本科生开放性实验的总结与收获
国家综合实力的提高取决于科学技术的进步,要实现这一目标就需要大量创新型人才。作为人才培养基地的高校,重视学生综合素质提高和创新能力的培养,实验教学体系的建立是实现此目标的有效途径之一。生物技术专业本科生通过在微基因药物实验室的开放实验,了解从上游基因构建→工程菌的筛选与发酵→蛋白质分离、纯化与性质鉴定→生物学活性检验(药效学实验)的基因工程药物的基本研究过程[1],学习了如何设计和构建基因工程菌,掌握了PCR技术,参与了菌种的保管与归档等工作,实验操作技能得到提高,培养了严谨、科学的工作态度,激发了学生的学习积极性和创新意识,为探索有效的实验教学体系积累了经验,现将在微基因药物实验室进行开放性实验过程中的体会总结如下:
学习和掌握微基因药物实验室基本操作技能
1.利用PCR技术获取目标基因
PCR技术,即多聚酶链反应(polymerase chain reaction), 是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mulis在1985年发明的一种体外快速扩增目标DNA的方法。主要有三个基
本步骤:
A.双链DNA高温变性解开成单链:加热到94℃,10min。 B.DNA半保留复制:变性、复性、延伸。具体为94℃、1min,55-60℃、1min,72℃、1.5min;25-30个循环 C.DNA链的延伸:72℃,10min。 2.载体
载体用于目的基因插入或克隆,并且有传递、运输外源DNA导入宿主细胞的能力。实验室里常用的载体主要有两类,分别为(1)能使外源基因在宿主细胞中转录和表达的表达载体(如pKK233-2、pET28-a、pED等)和(2)用于繁殖DNA片段的克隆载体(如pBR322、pUA118、pUA119等)[2]。 3.宿主菌
宿主菌用来接收携有目标基因的外源载体,繁殖载体或用来表达目标基因编码蛋白的细胞,有原核系统的大肠杆菌,如BL21、JM105、JM107、DH5等[3],也有用于真核表达系统的毕氏酵母等。 4.基因工程相关的酶
(1)限制性核酸内切酶:是一类能够识别和切割某种特定核苷酸序列的水解酶,实验室常用的限制性核酸内切酶有HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ等。
(2)DNA连接酶:它是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离得到,其功能是催化具有5'-磷酸基与3'-羟基末端形成3',5'-磷
酸二酯键。
(3)DNA聚合酶:其功能是以DNA为模板,在引物、底物等条件下,以碱基互补原则合成新DNA链,本实验室内常用的DNA聚合酶来自水生嗜热菌,称为TaqDNA聚合酶;另外一种常用的DNA聚合酶是PfuDNA聚合酶,由于它有3'→5'外切酶活性,能够修复错配的碱基,是目前保真度最高的DNA聚合酶。
参与实验室工程菌菌种的管理
1.菌种保存方法
(1)传代培养保藏法:利用琼脂平板或斜面培养,培养后于4―6℃冰箱内保存,此方法简单易行,但菌种保存时间短,易发生菌种污染。
(2)甘油管保存:生理盐水或LB培养基洗脱琼脂斜面上的菌苔,加入体积为20%的甘油-20℃保存。
(3)牛奶管保存:用脱脂牛奶洗脱培养在琼脂斜面上的菌苔,冷冻干燥后-20℃保存。这种方法是目前微基因药物实验室菌种保存的主要方法。 2.菌种保存时涉及的知识 (1)酶切位点
限制性核酸内切酶水解DNA分子上的特殊核苷酸顺序,实验室里常用如EcoRⅠ切割的位点是G'AATTC、HindⅢ的酶