实验2 分离以尿素为氮源的微生物
[学考报告]
知识内容 考试属性 考情解读 1.进行微生物分离。使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细菌。 2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌分离以尿素为氮源的微生物 加试 的存在。 3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。 4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌
一、以尿素为氮源的微生物 1.尿素
又称脲，是蛋白质降解的产物。在人和其他哺乳动物如家畜的尿中都含有尿素，植物不能直接吸收尿素，因此大量尿素的存在将对环境造成污染。
2.以尿素为氮源的微生物
这些细菌可以尿素为氮源，是因为其含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。其利用尿素的反应式为：(NH2)2C＝O＋H2O――→2NH3＋CO2。
3.分离以尿素为氮源的微生物所依据的原理
在氮源只有尿素时，这些微生物能利用尿素获得氮源而存活；而其他微生物却不能利用尿素，最终因为缺乏氮源而死亡。
二、从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物实验 1.实验目的
(1)使用以尿素为唯一氮源的培养基分离含有脲酶的细菌。
(2)通过指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的化学反应(培养基pH的变化)。 (3)统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生物的数量。 2.实验原理
(1)用选择培养基(培养基类型)可分离出以尿素为氮源的微生物。
(2)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌产生的脲酶将培养基中的尿素分解成氨，使培养基变碱，pH升高，酚红指示剂变红。
(3)根据培养基中的菌落数，可统计土壤样品中含有的这种微生物的数量。
脲酶
3.实验步骤
(1)倒平板：在60 ℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。
(2)制备细菌悬浮液
将土样1 g，在无菌条件下加到有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，制成10稀释液；从该稀释液中取0.5 mL悬液加到4.5 mL无菌水的三角瓶中，经振荡就制成10稀释液；再从1010
－4
－3
－2－3
稀释液中取0.5 mL悬液加到4.5 mL无菌水的三角瓶中，经振荡就制成
－
－
稀释液；依此法可依次制备出105、106……土壤稀释液。 (3)用稀释涂布分离法分离细菌 取10
－4
和10
－5
的土壤稀释液各0.1 mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿
中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
(4)培养：将培养皿倒置，在37 ℃恒温箱中培养24～48 h。 (5)观察、计数菌落：比较LB培养基与尿素培养基上的菌落数。
培养基 细菌悬浮液稀释度 104 －105 －对照组 LB全营养固体培养基 实验组 尿素固体培养基
1．为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？
提示：琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含氮化合物，用琼脂糖替代琼脂后，微生物只能以尿素为唯一氮源，利于对细菌的筛选。
2．有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？
提示：如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，与其他阴离子形成化合物则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用所形成的氨，有利于自然界的氮循环。
3．有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？
提示：此细菌能分解尿素产生氨，氨为碱性，酚红指示剂在碱性下为红色，标志着存在脲酶水解尿素的作用，红色区域大小代表脲酶活性强弱和含量的多少。
4．与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？ 提示：说明能利用尿素的细菌只占少数。
常用的微生物分离纯化方法
1.稀释涂布平板法
(1)液体稀释法：将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。该法是将已熔化并冷却至约60 ℃(减少冷凝水)的琼脂培养基，先倒入无菌培养皿中，制成无菌平板。待充分冷却凝固后，将一定量(约0.1 mL)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用玻璃三角刮刀涂布，使菌液均匀分散在整个平板表面，倒置恒温箱中培养。
(2)涂布平板法：可省去含菌样品悬液的稀释，直接吸取经振荡分散的样品悬浮液1滴加入1号琼脂平板上，用一支玻璃刮刀均匀涂布，用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定)，翻转此刮刀再涂布5号、6号平板，经适温倒置培养后挑取单个菌落。
2.平板划线分离法
将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环蘸取少量待分离的菌液，在培养基表面平行或分区划线如下图，然后将培养皿放入恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。几种划线方法如图：
(1)倒平板时，按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、
编号和实验日期。
(2)划线时在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
3.利用选择培养基进行分离
不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。此实验用到的选择培养基必须含有碳源、尿素、无机盐、水、酚红。
(1)判断培养基制备是否合格的方法是将接种的培养基和未接种的培养基
同时放入37 ℃ 恒温箱中培养24～48 h，观察未接种的培养基上是否有菌落生长。如果未接种的培养基上无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
(2)判断选择培养基是否起选择作用，可将LB全营养培养基和选择培养基分别接种，同时放入37 ℃恒温箱中培养24～48 h，观察两种培养基上菌落数目的多少。如果选择培养基上的菌落数远少于LB全营养培养基上的菌落数，则证明选择培养基确实起到了选择作用。
4.菌丝尖端切割
菌丝尖端切割适于丝状真菌。用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落。
1．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( )
A．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源 B．如果要测定②中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法 C．若图中④为对照实验，则其中应以苯酚作为唯一碳源 D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落 答案：C
2．微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的。请回答有关微生物及其应用的问题：
(1)培养微生物的培养基配方中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。从土壤中分离分解尿素的细菌时，培养基中加的唯一氮源为________，这种培养基称为________培养基。
(2)在制备固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，为什么要将平板倒置？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。