RNA提取标准流程

RNA提取标准流程

RNA提取标准流程

原理:

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中,取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。

预防RNase污染注意事项:

1. 经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。 2. 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3. RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌,然后烘干即可。

4. 配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.05% v/v,充分混匀后37oC放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作。)

RNA的提取

准备试剂:氯仿,异丙醇(可保存在-20oC,用时取出置于冰上),75%乙醇,无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer(宝生物工程(大连)有限公司,货号:D603,35元,1mL×5支)

准备器材:1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Ep

pendorf管若干、报纸、卷纸、研钵,以上物品全部需要高压。

操作步骤:

1. 研磨+匀浆:将组织在液氮中磨碎(大体积不均一的样品,如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体,必须对整个组织研磨),取50~100 mg组

织样品(肝脏可减少样品量到30 mg)放入2 mL离心管中,称重记录;均一组织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50~100 mg组织加入1 mL TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。 2.将匀浆样品在室温(15~30oC)放置5 min(可延长到15 min),使核酸蛋白复合物完全分离。

可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,

多糖(如肝脏和肌肉中的糖原)或胞外物质(肌肉)可于2~8℃ 10000 × g离心10 min,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量基因组DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。

3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿,剧烈振荡60 s(可使用混匀器,也可手动剧烈颠倒混匀),室温放置3 min。(可延长震荡时间和放置时间到15 min,同GTC法)

4. 4oC 10000 × g离心15 min。样品分为三层:底层为红色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。(即1mL最多600μl,为保证RNA质量,可适量减少抽取量,防止抽到下层) 5. 记录抽取水相的量,把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中,用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。

a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇,

室温放置10 min。

b. 可选:应对糖原含量较高的组织(如肌肉和肝脏):每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液(0.8 M柠檬酸

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