学习-----好资料
说明：下面黄色标注的为必须改的地方，其他地方自己酌情修改。 2013年生物化学实验B 实验报告 姓 名： 学 号： 实验时间： 2013年10月20日 实验分组： 第七组 组内成员： （） （） （） 任课教师：
更多精品文档
学习-----好资料
小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、
SDS-PAGE电泳法测定蛋
摘要 本实验通过从小牛肠中提取小牛肠碱性磷酸酶，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，并测定酶的活性。最后通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量.
关键词 小牛肠碱性磷酸酶提取 酶活测定 考马斯亮蓝法 SDS-PAGE电泳法
本实验分为三部分。先通过对牛小肠内膜的刮取，离心，沉淀析出等方法，提取牛小肠碱性磷酸酶；然后用考马斯亮蓝G-250与碱性磷酸酶结合，利用紫外分光光度计在一定波长下测定结合物的吸收波长，根据其吸光度与蛋白质结合物的含量成正比的关系测定蛋白质含量，进而测定出蛋白质的比活力；最后，通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，分析所获得的电泳结果来推算出被测蛋白质分子量的近似值。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
1.1.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定 1、 试剂
（1）正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存） （2）1mol/L醋酸（HAC）、1mol/LNaOH、硫酸铵
（3）平衡缓冲液：0.01mol/LTris-HCL,PH 8.0,(含1.0×10-3mol/LMgCl2和1.0×10-5mol/LZnCl2)。 （4）底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液（PH9.8，含0.5×10-3mol/LMgCl2）。
（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。（已加入底物缓冲液中） 2、仪器
匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿
1.1.2考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1、试剂
考马斯亮蓝、实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定所得酶液、生理盐水 2、仪器
分光光度计、分析天平、玻璃比色杯、试管及试管架、移液枪 1.1.3 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量 1、试剂
1）30%丙烯酰胺（acrylamide,Acr）置棕色瓶。
2）分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH8.8，已加入10%SDS。 3）浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH6.8，已加入10%SDS。
4）10%过硫酸铵（AP）（小离心管装，提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必须的自由基，须新鲜配置。） 5）TEMED（四甲基乙二胺）（小离心管装T，通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）
更多精品文档
学习-----好资料
6）上扬缓冲液（小离心管装S）：称100mgSDS、2mg溴酚蓝、2g甘油，加0.1mL巯基乙醇、2mL-。-5mol/LpH8.0Tris-HCL,加超纯水定容至10mL。
7）染色液：配置含0.1%考马斯亮蓝R250,40%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用。
8）脱色液：500mL10%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的脱色液1000mL。 9）电泳缓冲液（含0.1%SDS，0.05mol/LTris，0.384mol/L甘氨酸pH8.3）. 2、仪器
电泳仪、电泳槽、制胶板、摇床、移液枪 1.2 实验过程
1.2.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定 1、酶的分离提纯
1）取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮去小肠内粘膜，放到盘子一角。
2）统一将小肠黏膜液集中倒入匀浆机中，加1.5倍体积冰冷蒸馏水，高速匀浆15s，重复20次。 3）缓慢加入（总体积）1倍体积的冰冷正丁醇，高速匀浆15s，重复20次。
每组领取60mL的匀浆液，放入离心管中（离心管装液量不能超过70%），用另一离心管用水配平（切记离心前连同离心管盖子一起用天平配平），在4℃条件下，10000rpm，离心15min（离心管对称放置）。
4）用滤布过滤去除杂质（滤饼），倒入分液漏斗中，静止分层（勿摇），去下层水相，用1mol/LHAc调pH到4.9。4℃，10000rpm，离心10min。
5）得到上清26.5mL，放入离心管中，用1mol/LNaOH调pH至6.5，称取质量为溶液体积5%的硫酸铵1.33g(5g硫酸铵/100mL溶液)，加到离心管中溶解；再加0.47倍体积（12.45mL）冰冷丙酮，混匀，4℃（冰箱中）静置30min以上。4℃，10000rpm，离心10min。
6）上清液36.5mL中加入1.07倍体积（39.06mL）冰冷丙酮，4℃静置30min以上。4℃，10000rpm，离心10min。 7）取沉淀溶于2mL平衡缓冲液至全部溶解。置冰箱保存待用。 2、底物处理
底物（对硝基苯磷酸二钠已溶于平衡缓冲液中）37℃水浴5min（注意：根据分光光度计使用情况，要检测前加热）
3、酶活检测
1）将酶稀释10倍（配制取10μL，溶于90μL平衡缓冲液中得到）
2）紫外分光光度计检测条件：405nm波长，测定时间60s，取值2s，记录范围0.0-1.5。 3）取2个2mL比色皿（0.5cm光程），加入1.5mL上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。
4）将稀释10倍的酶液10μL加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速上下倒2次，放回分光光度计中，测定没动力学曲线。
1.2.2考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1、玻璃试管中加入5mL考马斯亮蓝。
2、在1.5mL离心管中，取上一实验得到的酶液分别稀释50、100、200倍。
3、各取100μL加入到5mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5min以上，另各取100μL生理盐水分别加入到5mL考马斯亮蓝试管中。（观察蓝色，以浅蓝色为好）
4、紫外分光光度计检测条件：595nm波长
5、取2个比色皿（1cm光程）加入考马斯亮蓝（比色皿的2/3），分光光度计中校对归零。
6、将样品放入外侧比色皿中，读吸光值（得到医治蛋白浓度标准曲线范围内的度数即可，0.1-0.5之间）。 7、根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度（乘以相应稀释倍数即得原始酶液蛋白浓度，注意单位） 1.2.3 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量
1、装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条（棱朝上，平铺），用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子（注意下面2个夹子要水平，两侧夹子离梳子底部1-0.5cm，表明分离胶加的位置），垂直放置在水平台面上
更多精品文档