1 目的
规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。 2 依据
《中国药典》2015版。 3 范围
本标准适用于微生物限度检验。 4 责任
中心化验室负责人：对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。 5 程序
5.1 执行标准：《中国药典》2015版。 5.2 抽样：照《取样标准操作规程》进行。 6 内容
6.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数
计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。 6.1.1设备、仪器及用具 6.1.1.1 设备
微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱（30～350C）、生化培养箱（20～250C）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。 6.1.1.2仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。 6.1.1.3用具
大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。 6.1.2试液 6.1.2.1 消毒液
A．0.1% 新洁尔灭溶液 B．75%乙醇溶液
6.1.2.2稀释液、试剂及配制
A．pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。
B．聚山梨酯80
C．无菌十四烷酸异丙酯 D．pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 6.1.3 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基 6.1.4操作方法 6.1.4.1试验前准备
6.1.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（1ml、10ml）、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
6.1.4.1.2开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。 6.1.4.1.3操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。进入二更，用0.1% 新洁尔灭溶液洗手，穿戴洁净无菌服、口罩、手套。
6.1.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。 6.1.4.2供试液的制备
根据供试品的理化特征与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
6.1.4.2.1水溶性供试试品
取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.1.4.2.2水不溶性非油脂类供试品
取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液
将供试液进一步10倍系列稀释。 6.1.4.2.3油脂类供试品
取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成1：10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。 6.1.4.2.4肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液，置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1：10的供试液。 6.1.4.3 供试液的稀释
取1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为1:100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:1000、1:10000等适宜稀释级。每递增1稀释剂，必须另换一支吸管。 6.1.4.4 检查法 6.1.4.4.1检验量
检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml、cm2）。
一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。 6.1.4.4.2平皿法
6.1.4.4.2.1 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液的制备和菌数测
定，每稀释级每种培养至少制备2个平板。
6.1.4.4.2.2阴性对照以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 6.1.4.4.2.3 倾注培养基
将预先配制好的培养基（需氧菌总数计数用胰酪大豆胨琼脂培养基，霉菌和酵母菌总数计数用沙氏葡萄糖琼脂培养基）熔化，置45。C水浴中，备用。将45。C左右的琼脂倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝。 6.1.4.4.2.4 培养和计数
需氧菌总数计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养3～5天。霉菌和酵母菌总数计数