反相高效液相色谱光电二极管阵列检测器法测定苦丁茶中乌索酸的含量
【摘要】 目的建立苦丁茶中乌索酸含量的测定方法，同时采用光电二极管阵列检测器检测乌索酸色谱峰的纯度。方法色谱柱为Nucleosil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相为甲醇水(87∶13)，流速0.8 ml/min，检测波长210 nm，柱温26℃。结果乌索酸在1.636～17.724 μg（r=0.999 8）范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系，乌索酸的平均回收率为99.3 % (RSD为1.7 %)。结论 该方法样品处理简单，准确度高，分离效能好，适合于苦丁茶叶中乌索酸含量的测定。
【关键词】 苦丁茶；乌索酸；高效液相色谱；光电二极管阵列检测器 Determination of Ursolic Acid in Ilex kudincha by RP ZOU Sheng
qin, CHEN Wu*,WU Xiao
chun
HPLC
PAD
Bioengineering Research Institute of Yichun University·Key
Laboratory of Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines,Yichun,336000,China
Abstract：ObjectiveTo develop a method for the quantitative analysis of ursolic acid and oleanolic acid in Ilex kudincha C. J. Tseng and at the same time the purity of ursolic acid peak was
detected by means of Photodiode Array Detector(PAD).MethodsHPLC was carried out on the Nucleosil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 26℃ with MeOHH2O(87∶13) as mobile phase. The flow rate was 0.8 ml and the detection wavelength 210 nm. ResultsThere was good linear relationship between the peak area and the sample content injected in the ranges of 1.636～17.724 μg（r=0.999 8）for ursolic acid. The average recovery rate of ursolic acid was 99.3% (RSD1.7 %). ConclusionThe method is simple, accurate, and suitable for the determination of ursolic acid in Ilex Kudincha C. J. Tseng.
Key words:Ilex kudincha C. J. Tseng ; Ursolic acid; HPLC; PAD
苦丁茶Ilex kudincha C. J. Tseng为冬青科(Aquifoliaceae)
冬青属植物，性凉，味甘苦，有散风热清头目、除烦渴的功效。苦丁茶主要分布在广东、广西、湖南、湖北、海南等地，是我国南部及西南部民间传统的天然药用植物，具有清热解毒、生津、提神、益智、抗衰老、调节血压、降脂等药理作用［1］。苦丁茶主要含三萜类、黄酮类、木脂素、氰基化合物、甾醇、氨基酸和苦味素等化学成分［2］。现代药理研究表明，苦丁茶中的乌索酸具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌及降血脂血糖等多种药理活性，具有重要的药用开发价值［3］。苦丁茶药理、化学成分研究已有很多报道，但其质量评价方法报道较少。本实验采用高效液相色谱法对不同产地苦丁茶产品中的乌索酸含量进行了测定，为评价其质量提供依据。 1 仪器与试药 1.1 仪器
高效液相色谱仪，Waters515型泵，2996光电二极管阵列检测器，7725I 进样阀，Empower 中文色谱工作站（美国）；RO-MB-10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP2250分析天平（德国Sartorius公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；KS-1500超声提取仪器（宁波科盛仪器厂）。
1.2 试药甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂），水为高纯水，乙醇为分析纯（95%，江西同盟试剂化工厂），乌索酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110742-200314，供含量测定用）。苦丁茶(市售)，经鉴定为冬青科植物苦丁茶Ilex Kudincha C. J. Tseng的叶。 2 方法与结果 2.1 色谱条件
色谱柱Nucleosil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-水（87∶13，V/V）；流速为0.8 ml/min；检测波长为210 nm；柱温为 26°C。乌索酸理论塔板数大于10000，分离度大于1.5。对照品溶液及苦丁茶样品溶液的HPLC色谱见图1。 2.2 溶液的制备
2.2.1 混合对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品8.18 mg，置于10 ml容量瓶中，加流动相溶解，定容，作为乌索酸对照品混合溶液。
2.2.2 样品溶液的配制 取苦丁茶样品于80℃恒温干燥10 h，粉碎，精密称取约3 g，加入95 %乙醇溶液40 ml，超声提取60 min，冷却至室温，滤过，滤渣用乙醇超声洗涤2次，合并过滤液于50 ml容量瓶，乙醇定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得样品溶液。
2.3 线性关系实验精密吸取对照品溶液2，6，10，14，18 μl，按2.1项下色谱条件进样并测定峰面积。以峰面积对进样量进行线性回归，乌索酸回归方程为：Y=5.62×105X+1.36×105，r=0.999 8。表明乌索酸进样量在1.636～17.724 μg之间时，线性关系良好。
2.4 色谱进样精密度实验精密吸取乌索酸对照品溶液10 μl进样，平行5次，测得乌索酸峰面积相对标准偏差（RSD）为0.9%（n=5），表明仪器精密度良好。
2.5 方法重现性实验精密称取苦丁茶样品5份，制备样品溶液，在上述色谱条件下，精密吸取10 μl进样分析，测得乌索酸峰面积的RSD为0.8 %（n=5），方法重现性良好。
2.6 加样回收率实验精密称取已知乌索酸含量并干燥至恒重的样品（广西钦州）5份，分别加入适量的乌索酸对照品，制备加标样品溶液，进样分析，计算乌索酸加样回收率。乌索酸平均加样回收率结果见表1。表1 乌索酸加样回收率实验结果（略）
2.7 乌索酸色谱峰纯度分析选取相同积分参数，采用Empower软件系统适应性模块对对照品和样品溶液中的乌索酸色谱峰积分，分析峰纯度，对照品和样品的乌索酸色谱峰纯度图中纯度线均位于自动阈值线下方（图2），色谱峰纯度角值小于阈值，证实乌索酸色谱峰为单一组分吸收峰，与色谱峰顶点、起始点和终止点光谱归一化叠加后结果相吻合［4］。
2.8 样品中乌索酸含量测定结果精密称取苦丁茶样品约3 g，制备样品溶液。精密吸取样品溶液10 μl，分别进样，平行实验3次，测定乌索酸峰面积，外标法计算乌索酸含量。结果见表2。表2 样品中乌索酸的测定结果（略）