分子生物学实验教学教案 (3000字)
河南科技大学
实验教学教案
课程名称 分子生物学
指导教师 李市场
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实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验目的 通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。 实验原理 将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染。
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC19质粒共保温,实现转化。由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC19，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC19。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
一. 仪器 控温摇床(37℃) 高速冷冻离心机
水浴锅 冰箱（-20℃,‐70℃）
超净工作台 培养箱(37℃)
752分光光度计 灭菌锅
二. 试剂 CaCl2 无菌水,冰
胰蛋白胨 酵母粉
Amp NaCl