北方民族大学生物科学与工程学院基础生物学实验
生物显微技术实验讲义
实验一、常用显微镜的使用
一、实验目的：
1 掌握各种显微镜的成象原理、熟悉各种显微镜的操作规范及注意事项； 2 了解各类显微镜的常见故障及排除方法； 3 了解各类显微镜的组装、维护及维修常识。 二、实验原理：
细胞是生物体的基本结构单位。构成生物有机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构入手。众所周知，细胞很小，绝大多数细胞人们通过肉眼无法辨认。所以，要借助显微镜的成象及放大原理，在显微镜下，特别是在电镜下才能观察到细胞的基本的形态结构。
（一） 普通光学显微镜的原理
通过显微镜的物镜和目镜的两次放大后，在人的眼睛的视网膜上形成一个正立的虚象，通过调焦装置使这个虚象落在眼睛明视距离25cm处，使所看到的物体最清晰，也就是说虚象是在眼球晶状体的两倍焦距之外，在眼球后的视网膜上形成一个倒立的的缩小像。 1 照明原理 临界照明和柯勒照明。 2 显微镜的分辨率
也称分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离。能把两点分辨开的最小距离叫做分别距离。分辨距离越小，则分辨率越高；分辨距离越大，则分辨率越低。所以分辨率是以分辨距离来表示的，并与分辨距离成反比。显微镜的分辨率和物镜的镜口率，照明光线的波长直接有关，其计算公式为：
D = 0.61λ / N. A. N. A. = n × sin a /2
式中D为分辨率，为光波波长， N. A. 为物镜的数值孔径（镜口率），n 为物镜与标本间介质的折射率，sin a/2为透镜视锥半顶角的正弦。
由上式可见，要增加分辨率，需从缩短波长和增大镜口率着手。由于镜口率受介质折射率和视锥半顶角的限制，它的数值是有一定限度的，所以，只有缩短光的波长，才是最有效的方法。
3显微镜的放大率
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放大倍数 = 目镜和物镜的放大倍数的乘积。公式为： M = K1 × K2 = ? / f1 ×250 / f2
M, 总当大倍数，K1， 物镜放大倍数； K2，目镜放大倍数；?，光学镜筒长（mm）；f 1, 物镜焦距（mm）;f2，目镜焦距(mm)；250为明视距离(mm)。
由公式看出，物镜的放大率是对一定的镜筒长度而定的，镜筒长度的变化，不仅放大率随之变化，而且成像也受到影响。因此使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度，所谓标准光学镜筒长度是指物镜的后焦点与目镜的前焦点之间的距离。国际上将显微镜的标准镜筒长定为160mm，此数字标刻在物镜的外壳上。 4 焦点深度
显微镜调焦到看清楚标本的某一点时，不仅是这一物点，而且其上下来两侧也能看清楚，能看清楚的这两侧的厚度叫做焦点深度。T = Kn / (M×N.A .)
K, 常数，约等于0.24； n， 被检标本周围介质的折射率；M，显微镜的总放大倍数；N. A. 为物镜的数值孔径。
由公式看出，显微镜的焦点深度跟其总放大倍数及物镜镜口率成反比。因此，高放大率和高镜口率的显微镜的焦深就浅，不能看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细从上到下进行观察。另外，被检物体周围介质的折射率的加大可增大焦点深度。 5 镜像亮度和视场亮度
镜像亮度：在显微镜下所观察到的图象的明暗程度。其与镜口率平方成正比，与总放大倍数成反比。即镜口率越大，镜像的亮度越大；总放大倍数越高，镜像亮度越小 视场亮度：显微镜下整个视场的明暗程度。其不仅与目镜、物镜有关，而且还直接受聚光镜、光栏和光源等因素的影响。在不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度大，镜像亮度就大。使用时，对镜像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不感到耀眼为宜 （二）荧光显微镜的成像原理
荧光显微镜是一种特殊的显微镜，其原理是利用较短波长的光使样品受到激发，产生较长波长的荧光，可用来观察分辨样品中产生荧光的成分和位置。一般用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统，发出一定波长的光（篮紫光420 nm或紫外光365 nm）作为激发光，激发标本细胞中荧光物质使其发出一定波长的荧光，产生的荧光图象，再通过物镜和目镜的放大，然后到底观察者的眼睛或光点接收系统。
用一定波长的光照射某些物质，一定量的光能被物质的分之或原子吸收后，激发出一种高能电子，进入激发状态。随后因该激发分子与其他分子的碰撞引起能量衰减回到基态。物质从激发态回到基态时可以电磁波形式放出其所吸收的光能，如果放出的光在激发的瞬间或
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激发后很短时间内放出，称为荧光。如将激发光切断仍持续发光，切光波更长，则称为磷光。 荧光显微镜的主要特点是其光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质获得必要强度的激发光，为了只让某一特定波长的激发光照射在样品上，必须在激发光源与显微镜之间的光路中安装滤光片，让激发光源的特定波长的光通过，作为激发光。为了得到专一的荧光，还需在物镜和目镜之间光路中安装一吸收滤光片，将样品吸收后剩余的激发光吸收掉，并能选择地让某一特定的荧光通过，而阻止非专一性的可见光。 三 实验仪器、材料：
日产BX41型系统显微镜、日产BX61型电动反射荧光显微镜、CX31型生物显微镜。 普通植物组织永久制片。 四 实验过程：
（一）BX41型系统显微镜的使用方法
1 将主开关拨到“1”（开），调节光强：镜基右后方旋钮，顺时针旋转提高电压，使照明更亮。旋钮周围数字指示电压。
2 选择光路：目镜筒右侧推拉杆，A 推进：100%，用于双筒目镜和暗样品材料观察；B 中间位置：20%和80%，用于双筒目镜，亮样品观察；C 拉出：100%，用于电视观察和显微摄影。
3 把样品放到载物台上：样品夹、标本推动器（X/Y轴旋转）。 4 将10倍目镜旋转进入光路：物镜转换器。 5 样品聚焦：粗、细调节螺旋。
6 调节曲光度（曲光度调节环）、聚光镜高度调节（调节环）
7 聚光镜对中调节：（1）将聚光镜升高到最高位置；（2）用10倍物镜聚焦样品；（3）移动视场光栏到视场中央；（4）转动聚光镜高度调节旋钮聚焦视场光栏图象；（5）调节两个句光镜对中旋钮把视场光栏的图象移动到视场中央。（6）逐步打开视场光栏，使视场光栏图象在中央并和视场内接。（7）在实际应用中，使视场光栏适当增大，视场光栏图象刚好与视场外切。
8 调节孔径光栏和视场光栏：孔径光栏调节环（与物镜的数值孔径匹配70-80%）；视场光栏调节环：限制进入物镜的光束直径，从而排除外来的光线，增强图象反差。应将视场光栏直径调节到物镜放大倍数范围内，使视场光栏刚好与视场外切。 9 将所需物镜转进光路，对样品聚焦：物镜转换器。 10 观察过程中绿色片的使用及光强调节： （二）BX61/62型电动系统显微镜的使用
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透射光明视场观察：
1 将主开关拨到“1”（控制盒前），打开灯开关（左下角）。
2 选择透射光（透射光/反射光切换开关），调节光强（右下角光强调节钮），选择LBD滤色片（右后长按钮）。
3 选择光路（目镜右后侧拉杆）。 4 将样品放到载物台上。 5 将10倍物镜旋转进光路
6 聚焦样品：（1）载物台升降钮（固定于滤色片选择按钮上方的两个旋钮）；（2）屈光度调节；（3）聚光镜高度调节；（4）聚光镜对中调节（需以六角改锥进行）。 7 调节孔径光栏和视场光栏：（同上）
8 将所需物镜转进光路聚焦样品：物镜转换钮、载物台升降钮、粗细调节旋钮。 10 观察过程中绿色片的使用及光强调节： 反射荧光观察：
1 按观察方法、安装与其匹配的荧光组件和物镜：不要同时使用明视场和荧光组件（分光镜），以免对人眼造成伤害。如果同时使用，要选择带内置ND滤光片的明视场组件；选择不同波长的激发滤光片（如果荧光亮度弱，选择超宽带激发；如果样品荧光很强，选择窄带激发）。
2 将主开关拨到“1”（控制盒前），等弧光到稳定状态（5到10分钟）。
注意：为了延长高压汞灯的寿命，一旦启动，不能在少于15分钟内关闭；关闭后若再次启动，必须等高压汞灯内的水银蒸气冷却下来液化后才能开启，至少要10分钟；在灯亮时打开室内照明灯，电源将被切断，此时要关闭汞灯电源，等10分钟后再重新打开电源。 3 选择反射光（透射光/反射光切换开关），调节光强（右下角光强调节钮）。
4 对中高压汞灯：（1）按下手动控制器，使光闸进入光路；（2）使用B或IB激发光，如没有这种分光镜可以使用紫外激发光，但要通过紫外遮光板观察；（3）使10倍物镜进入光路，将对中板（U-CST）放到载物台上，调节对中板白色表面上的十字线中心，使其与视场中心对中；（4）使空位置进入光路（取下物镜防尘帽）；（5）拉出孔径光栏旋钮使其最小，同时推进视场光栏拉杆，使其最大；（6）按下RSHT钮，移去光闸；（7）调节聚光镜调节旋钮和灯丝象对中旋钮（右后方）使灯丝的象投到U-CST板上；（8）转动光源灯丝象调节旋钮，将左或右半边的灯丝象调到中央。（9）使用六角改锥调节灯室后面的镜象调焦钮（背后）将灯丝象和镜象聚焦；（10）使用灯丝象调中旋钮使灯丝象和镜象重叠。 5 将标本固定在载物台上
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6 根据标本特性和研究目的选择与之匹配的荧光组件（分光镜）（控制盒键盘，MU+或MU-）。
7 旋转物镜，聚焦样品：物镜钮、光闸钮、载物台升降钮。
8 根据需要选择滤光片：插入时要听到两次卡塔声后方使滤光片在光路中，插入时使滤光片架的带刻字的一面朝向观察者。 9 调节聚光镜亮度：调到最大。 10 对中孔径光栏和视场光栏：（同上）。 11 转动物镜，聚焦观察。 （三）CX31型生物显微镜的使用 同一般显微镜的使用操作。 五 作业：
1简述BX41型系统显微镜的操作步骤。 2简述荧光显微镜的原理及使用是注意事项。
实验二、生物组织石蜡切片技术
第一部分 取材和材料的杀死
一 实验原理
用于制片的动、植物材料应该选择新鲜的，用陈腐的材料制片，往往不能反映材料的真实情况。固定是将新鲜材料投入某类化学药液中，借助化学药品的作用使细胞组织的形态保存下来不使其改变形态和变质的过程。 二 实验目的
通过教学要求学生掌握永久制片过程中的取材、切割、杀死（固定）等操作的原理、技术和注意事项；掌握固定液的配制和应用。 三 实验仪器、材料和试剂 双面刀片、镊子；
植物的茎、根、树皮等材料；
FAA固定液、4%戊二醛固定液、卡诺氏固定液。 四 实验过程 （一）取材的方法
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