鸡大肠杆菌血清型鉴定和药敏试验
鸡大肠杆菌血清型鉴定与药敏试验
（新科学院生物工程系 生物技术091班）
绪论
鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathgenicity E．coli，APEC)引起的急性或慢性细菌性传染病。本病目前呈世界性分布，国内各地的鸡群普遍存在感染并常有发病。该病的特征是病型多，包括急性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、眼炎、关节炎、脐炎、肉芽肿以及肺炎等，最常见的为气囊炎、输卵管炎[1,2]。在临床上往往不单独发病，一般继发于一些病毒性感染如新城疫、马立克氏病、传染性支气管炎等。现有的研究表明，APEC抗原性复杂、血清型多样，不同类型之间和不同地区之间致病菌的血清型差别很大[3]。鸡大肠杆菌病一年四季均可发生，各品种和各年龄的鸡均可感染，若不及时采取有效的防治措施，便会导致大量死亡。大肠杆菌易产生耐药性，用药物控制该病不但费用高、效果不佳，且会造成药物残留和降低产品品质，为此，有效防治该病就显得尤为重要。本研究对新乡地区某鸡群发生的疑似鸡大肠杆菌病进行了初步诊断，并采集典型病料进行病原菌的血清型鉴定和药敏试验，取得了理想效果，为该病的确切诊断和有效防治提供了可靠依据。现将有关情况报告如下：
1材料与方法 1.1 病料来源
对来自新乡市一养鸡厂疑似鸡大肠杆菌病的病例进行临床初步诊断[4]，病鸡表现为精神委顿，羽毛松乱，食欲废绝，拉黄白稀粪。用灭菌棉接触采集病鸡粪便作为病料。（材料由动科学院提供） 1.2 主要试剂
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鸡大肠杆菌血清型鉴定和药敏试验
草酸铵结晶紫（天津市博迪化工有限公司） 碘液、氯化钠（北京中联化工试剂厂）
牛肉浸粉、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限公司） 95%酒精（天津市天力化学试剂有限公司） 番红（天津市瑞金特化学品有限公司）
葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等微量发酵管（杭州天河微生物试剂有限公司） 葡萄糖、乳糖、猪胆盐、中性红（郑州派尼化工试剂厂） 营养琼脂（上海光星生物技术有限公司）
甲基红试剂、吲哚试剂、VP指示剂（天津市瑞金特化学品有限公司）
磷酸氢二钾、生理盐水、伊红、美兰、石碳酸、乙醚（广西汕头市西龙化工厂） 标准麦氏比浊管（北京红娃数字机电技术有限公司） 1.3 培养基
营养肉汤培养基 麦康凯培养基 伊红美兰培养基 蛋白胨水 营养琼脂培养基
1.3.1 培养基的制备[5] 营养肉汤培养基
蛋白胨 10g ，牛肉浸粉 3g ，氯化钠5g，蒸馏水1000ml
称取蛋白胨5g，量取蒸馏水1000ml，将牛肉浸粉倒入，边加热边搅拌，沸腾后停止加热，调pH至7.0-7.4，分装到试管中，加塞后在压力为0.11Mpa，温度为121℃条件下灭菌15分钟。备用。
麦康凯培养基
蛋白胨 20g,乳糖10g,猪胆盐 5g,氯化钠 5g，0.5%中性红水溶液 5mL ，0.01%结晶紫水溶液 10mL ，琼脂 17g，蒸馏水 1000ml
将蛋白胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL蒸馏水中加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min。备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。
伊红美兰培养基
蛋白胨 10g,乳糖10g,磷酸氢二钾2g,琼脂20g，2%伊红水溶液 20ml ,0.5 %美蓝水溶液 13ml ,蒸馏水1000ml
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鸡大肠杆菌血清型鉴定和药敏试验
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调整pH为7.2-7.4 ，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min。备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
蛋白胨水
蛋白胨20g,氯化钠5g，葡萄糖，蒸馏水1000ml
依次称取蛋白胨，氯化钠与烧杯中，加入蒸馏水，调节pH至7.4。分装小试管，121℃高压灭菌15min。 备用。（葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水
中加入葡萄糖1g））。
营养琼脂培养基
牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂20g、NaCl 5g、蒸馏水1000ml
依次将牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl ，溶于1000ml蒸馏水中，调节pH至7.4，分装，121℃高压蒸汽灭菌15min。备用。 1.4 大肠杆菌诊断血清
O1 (批号200904)，O2 (批号200901)，O5 (批号200605)，O8 (批号200901)， O9 (批号200901)，O11 (批号200904)，O14 (批号200211)，O15 (批号200709)，O18 (批号200408)，O19 (批号200709)，O20 (批号200407)，O21 (批号200901)，O24 (批号200709)，O26 (批号200709)，O35 (批号200901)，O36 (批号200505)，O50(批号200505)，O54 (批号200709)，O74 (批号200211)，O78 (批号200612)，O88 (批号200901)，O119 (批号200104)， O141 (批号200901)，O147 (批号200803)，O157 (批号200901)，E.coli标准抗“O”血清。以上均购自中国兽医药品监察所，均在有效期内。4℃保存备用。 1.5 药敏纸片
罗红霉素(批号：100531)，庆大霉素（批号：1001201），阿米卡星（批号：1010221），米诺环素（批号：1010132），阿奇霉素（批号：101213）,复方新诺明（批号：1009031），四环素（批号：1008311），头孢唑啉（批号：100901），头孢曲松（批号：1009252）和氧氟沙星（批号：1009022），均由北京天坛药物生物技术开发公司生产。以上药敏纸片均购自河南省生物所。 1.6 主要仪器
显微镜（AC220V IN 重庆光电仪器总公司）
恒温培养箱（PYX-DHS-50 X65-BS-II 上海跃进医疗器械厂） 灭菌锅（YMSI-280B 宁波市镇海金鑫医疗器械有限公司） 恒温干燥箱（DHP-9082 上海一恒科学仪器有限公司）
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