温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
（间接碘量法）
（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）
一、目的
1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 2.学习酶活性的判定 二、原理
酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。酶活性大，反应速度就快。反之则慢。酶促反应速度受多种因素的影响。如温度、pH、激活剂、抑制剂等。
本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种因素对酶活性的影响。
唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。
具体反应如下：
1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。
2、判定酶活性大小的化学反应过程：
Na2CO3 ＋2H2O —→ 2NaOH ＋ H2CO3 CuSO4 ＋2NaOH —→ Cu(OH)2↓＋ Na2SO4
5KI ＋KIO3 ＋ 3H2SO4 —→ 3I2＋3K2SO4 ＋3H2O
酶
淀粉 ———→麦芽糖 麦芽糖＋Cu++ —→麦芽糖氧化产物＋Cu+
Cu+ ＋ I2 —→ Cu++ ＋ 2I-
-
COO草酸钾COO- Cu++＋| —————→ | >Cu
COO- 防止逆反应 COO-
-
剩余I2 ＋ Na2S2O3 —→ 2I＋ Na2S4O6
（与淀粉呈兰色 ) （与淀粉无色 )
3、判定酶活性大小的标志
酶活性大 → 麦芽糖多 →Cu+ 生成量多 → I2 消耗量多 →
剩余I2少 → Na2S2O3 消耗量少
酶活性越大，Na2S2O3 消耗量越少。空白实验无酶活性，因此Na2S2O3 消耗量最多。与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。
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三、实验用品：
（一）器材
1.中试管16支。 2.试管架1个。 3.恒温水浴箱1台。 4.温度计1支。 5.50ml量筒1个。
6.吸管：0.5ml 1支，1ml 2支，2ml 1支 ，5ml 1支，10ml 1支。 7. 25ml、100ml烧杯各1个。 8.电炉子一个。 （二）试剂 1.2% 淀粉溶液
2.1N NaCl溶液：称取58.5gNaCl，溶于1000ml水中。 3.磷酸盐缓冲液
甲液：称取Na2HPO4·12H2O 23.9g溶于1000ml水中，既为M/15 Na2HPO4溶液，
此溶液pH为8.5。
乙液：称取KH2PO49.08g溶于1000ml水中，既为M/15 KH2PO4溶液，此溶液pH为4.5。
取甲液37.5ml，乙液62.5ml，两液混匀后既为pH 6.6磷酸盐缓冲液。 4. 0.01% HgCl2。
5.1N H2SO4溶液 ：取水约250ml，加入浓H2SO4 28ml，稀释至1000ml。 6.Shaffer-Hartman-Somogyi试剂（S、H、S试剂）
溶液A：结晶硫酸铜（CuSO4.5H2O）6.5g溶于100ml水中。
溶液B：酒石酸钾钠12g，无水碳酸钠20g，碳酸氢钠25g溶于500ml水
中。
溶液C：碘化钾10g，碘酸钾0.8g，草酸钾18g溶于300ml水中。 将溶液B倒入溶液A中混匀，再倒入溶液C混匀后定容至1000ml。 7.标准0.005N Na2S2O3溶液：取硫代硫酸钠（Na2S2O3.5H2O）25g溶于1000ml水中。此溶液浓度约为0.1N ，其准确浓度须用碘酸钾标准方法标定。（方法略）
取已调整至0.1N 标准Na2S2O3溶液50ml稀释至1000ml即为0.005N。
四、实验步骤：
1、制备稀释唾液：收集唾液于小烧杯内，吸取下层唾液0.5ml（要求无气泡）加入量筒内，用蒸馏水稀释至25ml，混匀备用。
2、取中试管8支，标号0—7，0号为空白对照，1-3号为测定温度对酶活性的影响，4-5号为pH对酶活性的影响，6-7号为激活剂和抑制剂对酶活性的影响
按下表操作。加入试剂及唾液后各管充分混匀。
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影响因素 管号 淀粉 NaCl 缓冲溶液 H2O 温度 稀释 温度 （ml） （ml） pH ml ml 时间 唾液 时间 空白 0 4.0 2.0 6.6 2.0 3.0 37℃ 10ˊ -- 37℃20ˊ 温度的 1 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 37℃ 10ˊ 0.5 37℃20ˊ 影响 2 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 10℃ 10ˊ 0.5 10 ℃20ˊ 3 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 80 ℃10ˊ 0.5 80℃20ˊ pH值的 4 4.0 2.0 4.5 2.0 2.5 37℃ 10ˊ 0.5 37℃20ˊ 影响 5 4.0 2.0 8.5 2.0 2.5 37℃ 10ˊ 0.5 37℃20ˊ 激活剂 6 4.0 — 6 .6 2.0 4.5 37 ℃10ˊ 0.5 37℃20ˊ 抑制剂 7 4.0 HgCL2 6 .6 2.0 2.5 37 ℃10ˊ 0.5 37℃20ˊ 的影响 （2ml）
3、充分混匀后开始保温，保温后立即由各管吸取2ml分别加入已预先加入2ml S、H、S试剂相应号码的试管中，并充分混匀。
4、各管放入沸水中加热8分钟。
5、向各管加入1N H2SO4 2ml，轻轻摇动至不产生气泡为止。 6、以0.005N Na2S2O3滴定各管，至蓝色消退为止。并记录结果。 7、由零号试管消耗Na2S2O3 ml数分别减去其余各管所消耗ml数，以此结果判定各种因素对酶活性的影响。
五、实验结果与分析（略）
管号 0 1 2 3 4 5 6 7 消耗ml数 差值 -- 思考题：
1.本实验判定酶活性大小的化学反应过程是什么？为什么酶的活性越大，消耗Na2S2O3越少？
3.加入H2SO4 的作用是什么？
3.根据实验结果分析温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响。
生物技术实验教学中心
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