温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响

温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响

(间接碘量法)

(effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme)

一、目的

1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 2.学习酶活性的判定 二、原理

酶活性大小可以用反应速度来表示,即在单位时间内,酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。酶活性大,反应速度就快。反之则慢。酶促反应速度受多种因素的影响。如温度、pH、激活剂、抑制剂等。

本实验是观察在不同温度,pH,以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种因素对酶活性的影响。

唾液中含有唾液淀粉酶,此酶可以使淀粉逐步水解,最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量(即还原性麦芽糖的多少)判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量,还原物多,酶活性大。

具体反应如下:

1、试剂成分(S、H、S试剂):CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。

2、判定酶活性大小的化学反应过程:

Na2CO3 +2H2O —→ 2NaOH + H2CO3 CuSO4 +2NaOH —→ Cu(OH)2↓+ Na2SO4

5KI +KIO3 + 3H2SO4 —→ 3I2+3K2SO4 +3H2O

淀粉 ———→麦芽糖 麦芽糖+Cu++ —→麦芽糖氧化产物+Cu+

Cu+ + I2 —→ Cu++ + 2I-

-

COO草酸钾COO- Cu+++| —————→ | >Cu

COO- 防止逆反应 COO-

-

剩余I2 + Na2S2O3 —→ 2I+ Na2S4O6

(与淀粉呈兰色 ) (与淀粉无色 )

3、判定酶活性大小的标志

酶活性大 → 麦芽糖多 →Cu+ 生成量多 → I2 消耗量多 →

剩余I2少 → Na2S2O3 消耗量少

酶活性越大,Na2S2O3 消耗量越少。空白实验无酶活性,因此Na2S2O3 消耗量最多。与空白实验进行对比,差值越大,说明此条件下酶活性越大。

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三、实验用品:

(一)器材

1.中试管16支。 2.试管架1个。 3.恒温水浴箱1台。 4.温度计1支。 5.50ml量筒1个。

6.吸管:0.5ml 1支,1ml 2支,2ml 1支 ,5ml 1支,10ml 1支。 7. 25ml、100ml烧杯各1个。 8.电炉子一个。 (二)试剂 1.2% 淀粉溶液

2.1N NaCl溶液:称取58.5gNaCl,溶于1000ml水中。 3.磷酸盐缓冲液

甲液:称取Na2HPO4·12H2O 23.9g溶于1000ml水中,既为M/15 Na2HPO4溶液,

此溶液pH为8.5。

乙液:称取KH2PO49.08g溶于1000ml水中,既为M/15 KH2PO4溶液,此溶液pH为4.5。

取甲液37.5ml,乙液62.5ml,两液混匀后既为pH 6.6磷酸盐缓冲液。 4. 0.01% HgCl2。

5.1N H2SO4溶液 :取水约250ml,加入浓H2SO4 28ml,稀释至1000ml。 6.Shaffer-Hartman-Somogyi试剂(S、H、S试剂)

溶液A:结晶硫酸铜(CuSO4.5H2O)6.5g溶于100ml水中。

溶液B:酒石酸钾钠12g,无水碳酸钠20g,碳酸氢钠25g溶于500ml水

中。

溶液C:碘化钾10g,碘酸钾0.8g,草酸钾18g溶于300ml水中。 将溶液B倒入溶液A中混匀,再倒入溶液C混匀后定容至1000ml。 7.标准0.005N Na2S2O3溶液:取硫代硫酸钠(Na2S2O3.5H2O)25g溶于1000ml水中。此溶液浓度约为0.1N ,其准确浓度须用碘酸钾标准方法标定。(方法略)

取已调整至0.1N 标准Na2S2O3溶液50ml稀释至1000ml即为0.005N。

四、实验步骤:

1、制备稀释唾液:收集唾液于小烧杯内,吸取下层唾液0.5ml(要求无气泡)加入量筒内,用蒸馏水稀释至25ml,混匀备用。

2、取中试管8支,标号0—7,0号为空白对照,1-3号为测定温度对酶活性的影响,4-5号为pH对酶活性的影响,6-7号为激活剂和抑制剂对酶活性的影响

按下表操作。加入试剂及唾液后各管充分混匀。

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影响因素 管号 淀粉 NaCl 缓冲溶液 H2O 温度 稀释 温度 (ml) (ml) pH ml ml 时间 唾液 时间 空白 0 4.0 2.0 6.6 2.0 3.0 37℃ 10ˊ -- 37℃20ˊ 温度的 1 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 37℃ 10ˊ 0.5 37℃20ˊ 影响 2 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 10℃ 10ˊ 0.5 10 ℃20ˊ 3 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 80 ℃10ˊ 0.5 80℃20ˊ pH值的 4 4.0 2.0 4.5 2.0 2.5 37℃ 10ˊ 0.5 37℃20ˊ 影响 5 4.0 2.0 8.5 2.0 2.5 37℃ 10ˊ 0.5 37℃20ˊ 激活剂 6 4.0 — 6 .6 2.0 4.5 37 ℃10ˊ 0.5 37℃20ˊ 抑制剂 7 4.0 HgCL2 6 .6 2.0 2.5 37 ℃10ˊ 0.5 37℃20ˊ 的影响 (2ml)

3、充分混匀后开始保温,保温后立即由各管吸取2ml分别加入已预先加入2ml S、H、S试剂相应号码的试管中,并充分混匀。

4、各管放入沸水中加热8分钟。

5、向各管加入1N H2SO4 2ml,轻轻摇动至不产生气泡为止。 6、以0.005N Na2S2O3滴定各管,至蓝色消退为止。并记录结果。 7、由零号试管消耗Na2S2O3 ml数分别减去其余各管所消耗ml数,以此结果判定各种因素对酶活性的影响。

五、实验结果与分析(略)

管号 0 1 2 3 4 5 6 7 消耗ml数 差值 -- 思考题:

1.本实验判定酶活性大小的化学反应过程是什么?为什么酶的活性越大,消耗Na2S2O3越少?

3.加入H2SO4 的作用是什么?

3.根据实验结果分析温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响。

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